第3章细胞生物学研究方法

1第三章细胞生物学研究方法2第一节细胞形态结构的观察方法一、光学显微镜(lightmicroscopy)技术二、电子显微镜(Electromicroscopy)技术31.分辨率(resolusion)：区分两个质点间的最小距离。R=0.61λ/nsinα/2其中:n=标本和物镜之间介质折射率;λ=入射光线波长；α=镜口角（样品对物镜镜口的张角）nsinα/2称为物镜的数值孔径(numericalaperature,NA)R=0.61λ/NA思考题：如何提高显微镜的分辨能力？样品物镜α452.放大倍数(magnification):最终成像的大小与原物体大小的比值。光学显微镜的最大放大倍数为1,000倍.电子显微镜的最大放大倍数为1,000,000.6一、光学显微镜（一）普通复式光学显微镜7（二）相差显微镜89Figure3-2.Interferencebetweenlightwaves.Whentwolightwavescombineinphase,theamplitudeoftheresultantwaveislargerandthebrightnessisincreased.Twolightwavesthatareoutofphasepartiallycanceleachotherandproduceawavewhoseamplitude,andthereforebrightness,isdecreased.101.原理：利用光的衍射和干涉特性使相位差变成振幅差，表现为明与暗的对比。2.两个特殊构件：环状光阑（annulardiaphragm）：位于光源与聚光器之间。相位板（annularphaseplate）：涂有光吸收物质和相位推迟物质。3.用途：能观察无色、透明、活细胞中的结构。1932年P．Zernike发明，1953年,诺贝尔物理奖。111.原理：利用两组平面偏振光的干涉，加强影像的明暗效果，能显示结构的三维立体投影。（三）微分干涉显微镜12132.应用：适于研究活细胞中较大的细胞器、颗粒及其运动。计算机辅助的DIC分辨率比普通光镜提高了一个数量级。应用这一原理制备的录像增差显微镜（video-enhancemicroscopy）可以观察微管上颗粒的运动。14（四）荧光显微镜151.原理：以紫外线为光源照射被检物体，使之发生荧光，然后在显微镜下观察物体的形态及其所在的位置。2.特点：光源不直接照明，而是激发能源；需特殊的滤色镜；分辨率高。3.用途：在光镜水平用于特异蛋白质等生物大分子的定性、定位。既可以观察切片，也可以进行活体观察。有免疫荧光技术和荧光素直接标记技术。16Fluorescenceimageofepithelialneuroncell17Singapore’sNationalInstituteofEducationUKUniversityofFloridaFrenchSingaporeSouthKorea18（五）激光扫描共聚焦显微镜191.原理：激光作光源，逐点、逐行、逐面快速扫描，获得样品不同层面的图像（称为光切片），再通过计算机组合成三维重构的影像。2.优点：分辨能力比普通光学显微镜提高1.4-1.7倍。3.用途：类似荧光显微镜，但能扫描不同层次，形成立体图像，在研究亚细胞结构与组分方面广泛应用。20laserconfocalscanningmicroscope,LCSM21LCSMImageofaXenopusMelanophoremicrotubulecytoskeleton(green)andthenucleus(blue)（六）倒置显微镜231.特点:物镜与照明系统颠倒。2.用途:用于观察培养的活细胞，通常具有相差物镜，有的还具有荧光装置。24(七)荧光共振能量转移技(Fluorescenceresonanceenergytransfer,FRET)检测活体中生物大分子纳米级距离和纳米级距离变化的有力工具,检测某一细胞中两个蛋白分子是否存在直接的相互作用。25490nm荧光供体（CFP）430nm激发光受体（YEP）26受体（YEP）490nm荧光供体（CFP）430nm激发光530nm黄色荧光27(八)荧光漂白恢复技术29（九）当代显微镜的发展趋势采用组合方式，集普通光镜加相差、荧光、DIC、摄影装置于一体。自动化与电子化。301932年德国学者MaxKnolls和ErnstRuska用波长比光短得多的电子作光源,发明了第一台电子显微镜，大大提高了显微镜的分辨率，开拓了超微世界。光学显微镜中观察不到而只能在电子显微镜下观察的结构称为亚显微结构（submicroscopicstructure）或超微结构（ultrastructure）。二、电子显微镜311.基本构造:(1)电子枪：包括灯丝阴极和阳极。阴极电压50~120KV，阳极0V，两极电压差为加速电压。电子束波长与加速电压的平方根成反比。(2)电磁透镜：改变电子方向。(3)真空系统：保持电镜真空。(4)照相系统：（一）电子显微镜的基本知识32显微镜分辨本领光源透镜真空成像原理光镜200nm可见光（400-700nm）玻璃透镜不要求真空利用样品对光的吸收形成明暗反差和颜色变化电镜0.1nm电子束（0.01-0.9nm）电磁透镜1.33x10-5～1.33x10-3Pa利用样品对电子的散射和透射形成明暗反差2.电镜与光镜的比较显微镜成像的基本要素有哪些?33电镜与光镜光路图比较34透射电子显微镜(1)透射电子显微镜(transmissionelectronmicroscope,TEM)3.电镜的类型3536(2)扫描电子显微镜（Scanningelectronmicroscope，SEM）37Figure3-32.Cellsinculture.Scanningelectronmicrographofratfibroblastsgrowingontheplasticsurfaceofatissue-culturedish.3820世纪60年代问世，利用二次电子信号成像来观察样品表面形态。工作原理：电子束扫描样品，在样品表面激发出二级电子，由探测器收集，信号经放大后在荧光屏上显示出与电子束同步的扫描图像。分辨率为6~10nm，有效放大倍数为0.2mm/10nm=20000X。39(3)扫描隧道显微镜(scanningtunnelmicroscope,STM)Binning和Rohrer1981年发明，1986年获诺贝尔物理奖根据量子力学的隧道效应原理制成，分辨本领高，可在真空、大气、液体等多种条件下工作，非破坏性测量。是纳米生物学研究领域中的重要工具,可在原子水平上揭示样本表面的结构。40扫描隧道电镜下的DNA双螺旋411.超薄切片技术（二）电镜制样技术422.负染色(negativeStaining)和投影(shadowcasting)技术(1)负染色:使整个载网都铺上一层重金属盐,而凸出的样品则没有染料.(2)投影技术:又叫喷镀技术,增强背景和待观察样品反差.433.冰冻蚀刻(freeze-etching)冰冻断裂与蚀刻复型：主要用来观察膜断裂面的蛋白质颗粒和膜表面结构。44快速冷冻深度蚀刻技术(AYeastCell)454.电镜三维重构技术英国生物物理学家A.Klug提出,获得1982年诺贝尔化学奖。电子显微术、电子衍射与计算机图像处理相结合，分析难以形成三维晶体的膜蛋白、蛋白-核酸复合物等大的复合体。Three-dimensionalreconstructionfromserialsections.461、离心机:低速离心机：转速10,000r/min高速离心机：转速为10,000~25,000r/min超速离心机：转速25,000r/min。目前超速离心机的最高转速可达100,000r/min一、细胞器与生物大分子的分离第二节细胞组分的分析方法47LowspeedHighspeedDifferentialcentrifugation48（1）特点：介质密度均一；主要根据被分离物质的体积差异；速度由低向高，逐级离心。（2）用途：初步分离大小相差悬殊的细胞和细胞器，常需进一步通过密度梯度离心再行分离纯化。2、差速离心（Differentialcentrifugation）493、密度梯度离心（densitygradientcentrifugation)介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，待分离的各组分分别停留在介质的密度不同的层面。常用介质：氯化铯、蔗糖、多聚蔗糖。类型：速度沉降密度沉降50Figure3-36.Comparisonofmethodsofvelocitysedimentationandequilibriumsedimentation.511.Feulgen反应显示DNA2.PAS反应显示多糖3.四氧化锇显示脂肪4.米伦反应显示蛋白质二、细胞组分的显示521、免疫荧光(immunofluorescence)技术将免疫学方法与荧光标记技术结合起来研究特异蛋白在细胞内的分布。常用的荧光素有异硫氰酸荧光素、罗丹明等。有直接免疫荧光和间接免疫荧光。三、特异蛋白质的定位与定性53Figure3-8.Fluorescentdyes.Thestructuresoffluoresceinandtetramethylrhodamine,twodyesthatarecommonlyusedforfluorescencemicroscopy.Fluoresceinemitsgreenlight,whereastherhodaminedyeemitsredlight.54Indirectimmunocytochemistry552、免疫电镜（immunoelectronmicroscope）技术将样品进行特殊标记增强反差，从而进行亚细胞结构和分子的定位。根据标记方法不同分为：免疫铁蛋白技术、免疫酶标技术和免疫胶体金技术。56Immunogoldelectronmicroscopy.Electronmicrographsofaninsulin-secretingcellinwhichtheinsulinmoleculeshavebeenlabeledwithanti-insulinantibodiesboundtotinycolloidalgoldspheres.Mostoftheinsulinisstoredinthedensecoresofsecretoryvesicles;inaddition,somecoresarebeingdegradedinlysosomes.57原位杂交（insituhybridization）用标记的核酸探针通过分子杂交确定特殊核苷酸序列在染色体上或在细胞中的位置。(1)光镜原位杂交：放射性同位素或荧光素标记。(2)电镜原位杂交：生物素等小分子标记，胶体金显示。四、特异核酸序列的定位与定性58放射自显影（autoradiography）是利用放射性同位素所发射出来的带电粒子(α或β粒子)作用于感光材料的卤化银晶体,从而产生潜影。这种潜影可用显影液显示,成为可见的“像”。用于测定细胞内被放射性标记的物质。五、放射标记研究生物大分子的合成动态59放射自显影术601、显微分光光度术将显微镜技术与分光光度计结合起来，以物质的光吸收、荧光发射和光反射特性作为测定基础，用来分析生物样品细微结构中的化学成分，同时进行定位、定性和定量。2、流式细胞仪（flowcytometry）即可以对单个细胞或其他生物微粒进行定量分析，还可以对细胞或染色体进行分选。六、定量分析61Figure3-31.Afluorescence-activatedcellsorter.Whenacellpassesthroughthelaserbeam,itismonitoredforfluorescence.Dropletscontainingsinglecellsareg