第5章1 生物化学在环境科学中的应用

环境生物化学主讲教师：崔明超电话：[phone]办公地点：工程南楼403Email：[e-mail]第五章现代环境生物技术原理——5.1现代生物技术概述5.1.1现代生物技术定义以现代生命科学为基础，结合先进的工程技术手段和其他基础学科的科学原理，按照预先的设计改造生物体或加工生物原料，为人类生产出所需产品或达到某种目的5.1.2现代生物技术及应用广泛应用于农业、医药、化工、食品、环境保护等众多领域核心技术5.1.3现代环境生物技术美国密歇根州立大学的J.M.Tiedje教授认为，环境生物技术的核心是微生物学过程指的是直接或间接利用生物或生物体的某些组成部分或某些机能，建立降低或消除污染物产生的生产工艺，或者能够高效净化环境污染，同时又生产有用物质的工程技术高、中、低三个层次以基因工程为主导传统的生物处理技术利用天然处理系统目前环境生物技术面临的任务有：解决基因工程菌从实验室进入模拟系统和现场应用过程中，其遗传稳定性、功能高效性和生态安全性等方面的问题开发废物资源化和能源化技术建立无害化生物技术清洁生产新工艺发展对环境污染物的生理毒性及其对生态影响的检测技术——5.2酶工程基本原理酶工程是指利用生物有机体内酶所具有的某些特异催化功能，借助固定化生物反应器和生物传感器等新技术、新装置，高效优质地生产特定产品的一种新技术内容包括：对生活在极端环境条件下的嗜热菌、嗜冷菌、嗜盐菌、嗜碱菌、嗜压菌等微生物的研究受到人们的重视，试图从中找出具有特殊功能的酶在开发酶的新用途方面，最引人注目的是清洁生产工艺的运用，使污染最小化酶的生产与分离纯化酶分子修饰酶固定化酶反应动力学在环境污染治理、工业、医药、卫生和理论探索等方面的应用5.2.1酶固定化概念又称水不溶性酶，是通过物理吸附法和化学键合法将水溶性酶合固态的不溶性载体相结合，使酶变成不溶于水但仍保留催化活性的衍生物特点：稳定性强：载体有效保护酶的天然构型，不受酸碱有机溶剂等影响适合于连续化、自动化和管道化工艺，还可回收、再生合重复使用固定化酶可以设计成不同形式：如酶片、酶布、酶柱非水溶剂中的酶促反应水与酶分子的相互作用水是极性分子，可促进离子键和极性共价键化合物的解离；形成氢键时可作为质子的受体和供体酶分子与水相互作用，对于稳定酶分子复杂的立体结构和保持酶的催化活性具有重要意义；但水也参与多数引起变性的反应非水溶剂中的酶促反应酶在有机溶剂中保持催化活性的基本条件酶分子的周围必须存在一个水化层，其需水数量取决于酶的分子大小、形状、表面电荷、疏水及亲水性质等与酶紧密结合（主要是氢键）的“结合水”，对酶构象的形成和维持等起着关键的作用与酶松散结合起溶剂作用的“大量水”，可部分被有机溶剂取代一般来说，极性有机溶剂可以夺取酶水化层的大部分水，甚至结合水；而非极性溶剂夺取水的能力较弱非水溶剂中的酶促反应有机溶剂中酶促反应的特性微环境的变化由于水的存在而增强，酶的构象更具“刚性”适当条件下，改变平衡向有利于合成方向进行在有机溶剂中酶的稳定性得到显著提高大大降低了许多需要水参与的副反应可以省略产物的萃取分离过程，提高回收率脂溶性底物和产物在有机溶剂中的高度溶解性，有利于提高底物浓度总水平不存在微生物污染问题是一个非均相反应体系，应用振荡或搅拌改善底物及产物的交换是反应的关键固定化技术的研究阶段第一阶段：载体的开发第二阶段：辅酶系或ATP系和其再生系的建立疏水体系或含水率低的体系中固定化酶的催化反应研究添加防止固定化过程中酶活力下降的辅助物的研究固定化活细胞的研究年代研究者被固定物结果意义古代微生物附着在固形物上提高酿造效果最早固定化应用1916年Nelson和Griffin蔗糖酶吸附在骨炭微粒上保持与游离酶同样的活性现代生物固定化技术开端1969年千烟一郎固定化酰化氨基水解酶光学分离生产L-氨基酸实现了固定化酶的工业应用1973年千烟一郎聚丙烯酰胺凝胶包埋具有高活性天门冬氨酸酶的大肠杆菌生产L-天门冬氨酸将固定化酶技术发展为固定化细胞技术现在，它已由原来的单一的固定化酶、固定化微生物细胞发展到固定化动植物细胞、固定化细胞器、固定化原生质体、固定化微生物分生孢子以及酶与微生物细胞、好氧微生物与厌氧微生物的联合固定化等。其应用研究已涉及食品与发酵工业、化学合成工业、医疗诊断、环境净化、能源开发等各个领域，充分展示了生物固定化技术美好的发展前景。生物固定化技术的发展背景生物固定化技术的应用领域食品与发酵工业：高果糖浆的生产酒精和啤酒的生产氨基酸和有机酸的生产乳品工业医药工业废水生物处理能源开发生物传感器基础理论研究生物固定化技术的机理带电荷酶或细胞和带电荷的载体之间的静电相互作用细胞表面的氨基（-NH2）和羧基（-COOH）与载体表面上的反应基团之间形成离子键细胞表面的氨基或羧基和载体表面上的羟基等形成共价键包埋载体的孔径比生物催化剂更小，因而将生物催化剂保留在载体内，同时，底物可以进去，反应产物可以出来细胞表面的基团和载体上经化学修饰而特意接枝上去的集团之间形成共价键生物固定化的载体理想的固定化载体应具有对生物催化剂无毒、传质性能好、性质稳定、寿命长、价格低廉等特点目前常用的载体大致可分为有机载体、无机载体和复合载体三大类有机载体如琼脂、海藻酸钠（CA）、聚乙烯醇（PVA）、聚丙烯酰胺等，它们在形成凝胶时可将细胞包埋在凝胶内部从而达到固定细胞的目的，在废水处理中得到较多的研究和应用无机载体如活性炭、多孔陶珠、红砖碎粒等，利用其多孔结构对细胞的吸附作用和电荷效应固定细胞。相对于有机载体材料来说，无机载体材料大多具有成本低、寿命长,机械强度大和耐酸碱等特性而更具实用性。对于这方面目前研究尚不够充分有机载体与无机载体组成复合载体，结合了它们各自的优点，改进了材料的性能固定化酶的制备酶的催化活性依赖于酶的空间结构及活性中心。所以固定化时要选择适当的条件，力图不使其活性中心的基团受到影响。操作时应尽量在温和条件下进行，以尽量保持酶蛋白天然的高级结构酶固定化的方法载体结合法：以共价结合、离子结合和物理吸附等固定在非水溶性载体上：如葡聚糖、活性炭、胶原、琼脂糖、多孔玻璃珠、高岭土、硅胶、氧化铝、羧甲基纤维素等交联法：与两个或两个以上官能团的试剂反应形成共价键：如戊二醛、双重氮联苯胺和六甲撑二异氰酸酯包埋法：包埋在凝胶微小格子中，或包裹在半透性的聚合物膜内：如聚丙烯酰胺凝胶、聚乙稀醇、琼脂、硅胶等；尼龙、乙基纤维素和硝酸纤维素逆胶束酶反应系统：表面活性剂的两性分子在有机溶剂中自发形成聚集体，其亲水性一端连接成逆胶束的极性核，水分子插入核中，疏水性一端进入主体有机溶剂中，酶分子溶于逆胶束中生物固定化方法结合法物理分隔法载体结合法交联法物理吸附法离子结合法共价结合法生物特异性吸附法物理交联法化学交联法系统截留法载体分隔法包埋法微胶囊法生物固定化方法结合法物理分隔法载体结合法交联法物理吸附法离子结合法共价结合法生物特异性吸附法物理交联法化学交联法系统截留法载体分隔法包埋法微胶囊法大较大小较大空间位阻不能不能能不能载体的再生高高低高稳定性大小适中小适用性有无有无存活力低高低适中固定化成本适中低高低活性保留适中强弱强结合力适中难易适中制备的难易包埋法共价结合法吸附法交联法性能常用生物固定化方法的比较大较大小较大空间位阻不能不能能不能载体的再生高高低高稳定性大小适中小适用性有无有无存活力低高低适中固定化成本适中低高低活性保留适中强弱强结合力适中难易适中制备的难易包埋法共价结合法吸附法交联法性能常用生物固定化方法的比较固定化酶的性质底物特异性的改变：立体障碍使高分子底物与酶分子表面的邻近效应受到干扰最适pH的改变：最适pH的平行移动最适温度的变化：多数不发生变化动力学常数的变化：Km及Vm的变化稳定性变化：普遍增加当酶分子被结合到带负电载体上时，酶蛋白的阳离子数增多，从而造成固定化酶反应区域的pH比外部溶液的pH值偏酸，造成酶的反应是在比反应液的pH偏酸一侧进行，从而使最适pH值转移到碱性固定化对酶反应系统的影响酶构象改变：酶分子发生某种扭曲立体障碍：载体存在造成某种空间障碍微扰效应：分配效应：底物及各种效应物在载体内外侧浓度的不等分配扩散限制：与物质的分子量大小、载体的结构及酶反应性质有关由于底物的疏水、亲水及荷电性质，使得紧邻固定化酶的微环境区域发生变化，对酶产生微扰效应外扩散限制指底物、产物和其他效应物在宏观体系与酶颗粒表面间的扩散受到了限制，主要存在于酶颗粒周围的处于层流状态的液膜层内扩散限制指在多孔性固定化载体内，底物、产物和其他效应物在载体颗粒表面与载体内的酶活性部位间的扩散受到限制5.2.3酶在污染治理中的应用含酚废水处理造纸废水处理含氰废水处理食品加工废水处理含有残留有机氯农药土壤的处理微生物酯酶的应用酯酶具有在液相和有机相界面间起催化作用的独特性能某些细菌中含有一种特殊的甲烷单加氧酶（MMO），具有比较广泛的底物选择性，能够催化降解大多数氯代烃污染物——先转化成相应的醇，再在其它酶作用下分解成无害物质——5.3基因工程基本原理5.3.1基因工程概述基因工程的诞生：1973年Cohen理论上的三大发现技术理论上的三大发明I.1934年，DNA是遗传的物质基础——遗传信息的来源II.1953年，DNA双螺旋结构学说——遗传信息传递的方式III.1961年操纵子学说；1972年中心法则——遗传信息的流向与表达I.1970年和1972年限制性核酸内切酶和1970年DNA连接酶的发现II.1964年发现细菌的F-性因子，1973年首次将质粒用作载体III.1970年发现的逆转录酶，使真核基因的制备成为可能基因工程的定义：是利用重组DNA技术，在体外通过人工剪切和拼接等方法，对生物的基因进行改造和重新组合，然后导入受体细胞进行无性繁殖，使重组的基因在受体细胞中表达，产生出人类所需要的基因产物用于大规模生产生物分子改造现有物种及设计构建新物种寻找、分离和鉴定生物体的遗传信息资源基因工程的主要内容核心是DNA重组技术：获取目的基因并进行必要的改造选择合适的载体并加以适当的修饰将目的基因与载体连接，获得含有目的基因的重组载体将重组载体导入宿主细胞并筛选楚含重组DNA的细胞进行增殖5.3.2目的基因的获得从基因组DNA中分离基因的化学合成法通过RNA合成cDNA用聚合酶链反应（PCR）方法扩增目的基因片段基因文库与cDNA文库的构建基因的随机断裂方法限制性内切酶降解基因的核苷酸序列已知从3‘末端开始目前获得已知基因的主要方法聚合酶链反应，不需要借助于分子克隆，可以在体外快速繁殖和扩增DNA的技术原理：应用与待扩增的目的DNA片段两侧互补的引物，在DNA聚合酶的作用下，引发目的DNA片段反复复制，从而使目的DNA片段拷贝迅速增加的过程变性→退火→延伸DNA分子数目呈2的指数增加从耐热菌中纯化得到一种特殊的TaqDNA聚合酶，可在较高温度下催化聚合局限性：TaqDNA聚合酶缺乏校正功能，产生较高的错误掺入率指含有某种生物体全部基因片段的重组DNA克隆群体5.3.3基因工程载体指可以携带目的基因进入宿主细胞的运载工具具有自主复制能力，能带动外源基因在宿主细胞内复制和扩增具有较多的拷贝数，易于分离提纯分子质量相对较小，便于操作，并有足够的接纳目的基因的容量有供外源基因插入的多个单一限制性核酸内切酶位点，用于目的基因的克隆有一个或多个筛选标记常用基因工程载体质粒载体改造过的人工质粒，常用的有pBR322、pUC、pGEM等λ噬菌体载体DNA长48kb，插入型和取代型两种黏性质粒与人工染色体pBR3224363kb四环素抗药性基因标记由质粒和λ噬菌体的cos黏性末端构建而成，主要用于真核细胞基因组文库的构建5.3.4基因工程工具酶限制性核酸内切酶：Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型DNA聚合酶：大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ、Klenow聚合酶、热稳定DNA聚合酶、反转录酶DNA连接酶：T4DNA连接酶和大肠杆菌DNA