2016-3基因突变和损伤DNA的修复

第3章基因突变与损伤DNA的修复•基因突变的类型和符号•常用的几个突变株•突变发生的机理(自发突变，诱发突变)•保证遗传稳定的机制(损伤DNA的修复)第一节基因突变的类型和符号一、基因的符号nodA（nodule结瘤基因Ａ）;nifA（nitrogenfixation固氮基因Ａ）;trpA,trpB（tryptophan色氨酸）;trpA23,trpA46（同一基因的不同突变位点）;•leu-,strr;(营养缺陷，抗性)•lacZ-;(表型符号为正体LacZ);•Δ(lac,pro);（缺失）•trpA::Tn5;（插入）•E.coliJM109;E.coliDH5α;（菌株）E.coliJM109Δ(lac,proAB)trpA::Tn5二、基因突变的类型按照突变体表型特征不同分类：１、形态突变型，例如２、营养缺陷型Ade-３、抗性突变型Strr４、致死突变型5、条件致死突变型6、产量突变型按照突变所引起的遗传信息的改变分类：１、错义突变同一位置上的氨基酸改变GAA(E)→AAA(K)２、同义突变同一位置上的氨基酸不变GAA(E)→GAG(E)３、无义突变碱基突变后形成终止密码子GAA(E)→UAA(stop)１、碱基置换转换PyPyPuPu颠换PyPu转换比颠换更常见按照遗传物质的结构改变分类：２、移码突变（编码区）ATCGAATTCGGGTATTTAATCGAATTCGGGTATTTACGAATCCGAATTCGGGTATTTAATCCGGAATTCGGGTATTTAATCCGAGAATTCGGGTATTTA３、DNA片段插入和缺失DNA大片段的缺失或重复，在放线菌中缺失范围从几个基因到几十个基因。第二节常用的几个突变株营养缺陷突变株温度敏感突变株抗性突变株例：供体E.coli(HfrStrs)受体E.coli(F-Thr-Leu-Thi-Strr)在含有链霉素和硫胺素的基本培养基只能分离到苏氨酸和亮氨酸的重组子第三节突变发生的机理(自发突变，诱发突变)１、自发突变·碱基异构式引起DNA复制过程的错误a)碱基异构式C(氨基)C(亚氨基)A(氨基)A(亚氨基)G(酮式)G(烯醇式)G(酮式)G(烯醇式)T(酮式)T(烯醇式-2’)orT(烯醇式-4’)1,65,6OHb)碱基异构式引起DNA复制的错配A(a)T(k)G(k)C(a)正确配对错误配对G(k)T(e)A(a)C(i)A(i)C(a)G(e)T(k)A(a)T(k)C(i)A(a)C(i)C(a)G(k)例如：•环出效应•转座子环出效应２、诱发突变2-1物理诱变a)电离辐射诱变；Co60(χ)(γ)rayCs137(χ)(γ)rayH3(α)rayP32,,S35(β)ray卫星搭载诱变；高真空，强辐射，微重力(χ)(γ)ray穿透性（外照射处理）(α)(β)ray非穿透性（内标记处理）dNTP电荷及结构改变电离辐射引起DNA损伤的机理b)非电离辐射—UltraVioletlight(U.V)---pyrimidinedimer(TTdimer)isgeneratedbycovalentlinksbetweenadjacentTT∧2-2生物技术定点诱变基因的定点诱变•oligo-dNt介导的定点诱变合成与目标基因某区段互补并含突变位点的oligo-dNtDNAshuffling技术的基因诱变Mutants.Digestionligationtransformationselection2-3化学诱变a)干扰碱基合成的化学诱变剂6-Mercaltopurine5-AminoUracil5-氨基尿嘧啶(5-AU)和6-氮嘌呤(6-NP)b)碱基类似物导致的碱基错配(5-BrU)BrBr5-BrU(k)5-BrU(e)ReplicationBrU(k)BrU(e)ATGC复制错误A/TG/C掺入错误G/CA/TA(a)T(k)5-BrU(k)G(k)5-BrU(e)C(a)mispairingmispairingT(k)A(a)5-BrU(k)G(k)C(e)5-BrU(e)A(a)G(k)G(k)A(a)复制错误掺入错误5-BrU(k)5-BrU(e)5-BrU(k)5-BrU(e)ReplicationBrU(k)BrU(e)GC复制错误A/TG/C掺入错误G/CA/TInDNABrU(k)BrU(e)(normal)(isoform)BrU(k)BrU(e)难易AGGATCCTHNO2(NitrousacidNA)ACGHypoxanghineCUracilAXanthineCdeaminationHNO2c)碱基修饰引起的化学突变羟胺的致突变作用NH2OH(HydroxylamineHA羟胺)C(羟化)A(a)OHNH羟化胞嘧啶GCATd)烷化剂EMS(Ethylmethanesulfanate)CH3—S—O--CH2CH3OOMMSCH3—S—O--CH3OOSM(SulfurMustardsgas硫芥子气)HSCH2CH2ClCH2CH2Cl甲基化诱变效应；•使碱基多处发生烷化，导致DNA结构变异敏感位点H2NOOOCTN3,C4-NN3,C4-OAGN1,N3,C6-N,N7,C8N1,C2-N,N3,C6-O,N7,C8H2NONHH•Apurination(de-pu)脱嘌呤作用CH3CH2GMPCH3CH2-OC6-O-烷基嘌呤=TC4-O-烷基胸腺嘧啶=GGGCH2CH2—S--CH2CH2H•烷化碱基电离异构式错配•多功能烷化剂DNA分子交联畸变GXTO7-烷基鸟嘌呤e)嵌合剂和移码突变AO(AcridineOrange)扁平分子EB(EthidiumBromide)-ATTTTTCG--TAAAAAGC--ATTTCG--TAAAGC-TAOT-ATEBTTTTCG--TA分子插入异相退火AOEB-ATTTCG--TAAAGC--ATX’TTTTCG--TAXAAAAGC-----AAAAA---------TTTTT----AAAAA--TTTTT--AAAAA--TTTTT-RE---AAAAA------TTTTT------AAAAAA------TTTTTT---+重组XAAAAGC-第四节保证遗传稳定的机制（损伤DNA的修复）复制过程中的错配修复DNA的损伤修复基因的回复突变密码的简并致死突变多倍体……复制过程中的错配修复机制(ξ=10-11)DNAmismatch+-----A------------C---DNApol(ξ=10-8)经第二次校正ξ=10-11MRSMismatchRepairSystem注：polI具有3'--5'的核酸外切酶活性（瞬时，广义上的校对和修复功能）1、DNA的复制修复1-1MismatchrepairsystemDNApolymeraseligaseMCE(mismatchcorrectenzyme)3subunitsmutH,L,Sdamgenem6A甲基化酶Scanning新生链中错配碱基识别新生链中非m6A的GATC序列酶切含错配碱基的新生DNA区段MCEscanningDNA中的GATC(palindromicseq.)为m6A甲基化敏感位点平均每2kb左右有一GATCseq.3’-------C----------CTAG----------CTAG----5’5’-----------T----------GATC----------GATC----3’3’-------------------------------------------------------5’少梯度多（m6A）新生链MCEscanningendonucleasePolymeraseligaseGATCGATCCTAGCTAGTCGATCGATCCTAGCTAGTGATCGATCCTAGCTAGTA1-２(尿嘧啶-)N-糖苷酶系统---TAGC------ATCG------TAGC------ATG---U---TAGC---ung-aseGTUAU---TAGC------ATG---Apurinase(内切酶)---TAGC------ADNApolligaseTCG---光复活酶471aa2、DNA的损伤修复2-1光复活----TT--------AA--------TT--------AA--------TT--------AA--------TT--------AA----可见光激活2-2切除修复•BeforeReplication•Error-free•UvrA,B,CgeneEndonucleasesExonuclease•DNApol•Ligase切除修复步骤：•识别DNA链中的损伤部位•损伤部分被切离•修复•动画E.coli存活%U.V计量w.t.uvrA+recA+recA+uvra-recA-uvrA-recA.gene以某种方式参与DNA损伤修复2-3重组修复重组修复(strandtransferrepair)•Afterreplicationrepair•RecA,DNApolymerae•ligasegenesbeneeded2-4SOS修复JeanWeagleE.coliE.coliE.coliλ8010100mut.100%50%10%•E.coli中噬菌体损伤的DNA被修复A•U.V.诱导了E.coli的SOS修复(A&B)•SOS修复高频率的突变(Error-prone)ABCDNAdamaged300XsignalRecAcleavesLexASOSUmnCmutation---Beforeinducing.LexA-pRec-A,UmuC…11genesNeg.repression---U.V.damageDNASignal(S.S.DNAtailor5NtS.S.DNA)•一般lexA基因产物是阻遏蛋白•LexA蛋白抑制自身基因的表达•LexA蛋白阻遏SOS基因的表达•RecA高效表达•LexA过表达,但多数被RecA降解•SOS基因表达机制RecA-P;三种功能●DNA重组活性●与S.S.DNA结合活性●少数蛋白的proteinase活性当DNA正常复制时（无复制受阻，无DNA损伤，无TTdimer）RecA-p不表现proteinase活性当DNA复制受阻/DNAdamaged能量大量消耗细胞内原少量表达的RecA-p与S.S,DNA结合激活RecA-p的proteinase活性修复损伤LexA-p降解RecA-p高效表达300timesupSOSopen当DNA复制度过难关后SOSrepair是一种error-prone极强的修复机制是进化中形成的“竭尽全力，治病救人”的措施（正常状态下，SOS是关闭的）RecA-p很快消失LexAgeneonSOSoff3、突变的形成DNA未经修复经过修复/校正死亡突变率降低倾向差错修复(重组修复，SOS）避免差错修复(光修复，切补修复)形成突变不形成突变DNAdamaged/mispairing物理诱变，化学诱变，自发突变突变是在修复过程中形成的（非准确的修复）基因的回复突变（backmutation/reversemutation）回复突变的概念wildtypemutant(inphenotype)mutation(lowF.)backmutation(verylowF.)回复突变的分子机制a)AGC(Ser)ACC(Thr)AGC(Ser)b)AGC(Ser)AGG(Arg)AGT(Ser)c)AGC(Ser)AGG(Arg)AAG(Lys)ifSer≈Lysd)Intragenicsuppression(第二位点突变引起的基因内校正/密码子间两次错义突变的互补)第3章复习思考题1.什么是突变？有哪些类型？2.突变型lacZ-1是用AO处理E.coli诱导产生的，而lacZ-２是用５－BU诱导产生的，它们分别属于何种突变？为什么？通过对这些细胞中的半乳糖结构的研究能证实你的推断吗