第7章 生物传感器

§7-2生物敏感膜与固定化技术§7-3酶传感器上节内容回顾§7-2Slide2被测物质生物敏感膜生物学反应信息敏感元件电信号二次仪表第7章生物传感器生物传感器的基本组成被测物质生物敏感膜生物学反应信息敏感元件电信号二次仪表生物学反应：•酶促反应•免疫学反应•微生物反应•受体配体结合反应生物学反应信息：•离子变化•质子变化•气体分压变化……传感器元件：•离子选择性电极•场效应晶体管•热敏元件……§7-3第7章生物传感器Slide3酶传感器微生物和组织及细胞传感器免疫传感器传感器7-2-1生物敏感膜生物传感器的最关键部分；载有生物活性物质的膜层；生物活性物质：•迅速识别被测物质并与之发生化学反应；•具有高特异性和敏感性。膜材料：天然，人工第7章生物传感器图7.2.1生物敏感膜示意图Slide4生物敏感膜生物活性材料酶膜各种酶类全细胞膜细菌，真菌，动植物细胞组织膜动植物组织切片细胞器膜线粒体，叶绿素免疫功能膜抗体，抗原，酶标抗原§7-2生物敏感膜与固定化技术7-2-1生物敏感膜按照生物活性材料的不同，生物敏感膜可包括:Slide51.基于生物催化反应的生物敏感膜2.基于生物吸附的生物敏感膜3.基于天然生物膜和人工生物膜的生物敏感膜按照其分子识别原理，生物敏感膜可包括:§7-2生物敏感膜与固定化技术7-2-1生物敏感膜Slide6基于敏感膜中的特定酶与底物反应；在接触生物物质或有机物质后，发生催化反应；生成的化学产物，其中一种产物可有传感器元件所感知。§7-2生物敏感膜与固定化技术7-2-1生物敏感膜图7.2.2基于生物催化反应的生物敏感膜示意图Slide7基于生物亲和性物质（抗体-抗原，DNA-RNA等）；一方固定在膜上作为分子识别元件；特异性反应引起膜电位变化。§7-2生物敏感膜与固定化技术7-2-1生物敏感膜图7.2.3基于生物吸附的生物敏感膜示意图Slide8直接利用具有生物活性的天然生物膜或人工生物膜；§7-2生物敏感膜与固定化技术7-2-1生物敏感膜Slide9图7.2.4天然生物膜和人工脂质双分子膜生物敏感膜需要满足哪些性能？§7-2生物敏感膜与固定化技术生物敏感膜必须满足一定的性能，才能够达到实用的目的。稳定性；可重复使用；能直接进行底物分析；操作简单；使用方便。生物敏感膜的制备技术——固定化技术怎样才能够使得生物敏感膜满足以上特点？Slide10生物敏感膜制备的固定化技术载体生物活性物质§7-2生物敏感膜与固定化技术7-2-2固定化技术酶，辅酶，抗原，抗体，微生物菌体，激素，抑制剂，各种细胞器。丙烯酰胺系聚合物，甲基丙烯系聚合物，苯乙烯系聚合物，胶原，右旋糖酐，琼脂糖，纤维素，淀粉等天然高分子以及玻璃，矾土，不锈钢等无机物。Slide11例：酶的固定化方法固定化酶的制备方法、制备材料多种多样，不同的制备方法和材料，固定化后酶的特性不同。对于特定的目标酶，要根据酶自身的性质、应用目的、应用环境来选择固定化载体和方法。具体包括：(a)夹心法(b)吸附法(c)包埋法(d)共价连接法(e)交联法§7-2生物敏感膜与固定化技术7-2-2固定化技术图7.2.4酶的固定化方法7-2-2固定化技术Slide12制备方法：将生物活性材料封闭在双层滤膜之间优点：操作简单；不需要任何化学处理；固定生物量大；响应速度快；重现性好。缺点：稳定性较差（酶膜）。适用范围：微生物和组织膜。§7-2生物敏感膜与固定化技术7-2-2固定化技术图7.2.5夹心法示意图Slide13§7-2生物敏感膜与固定化技术7-2-2固定化技术制备方法：通过非水溶性载体的物理吸附或离子结合，使蛋白分子固定。优点：不需要化学试剂；对酶活性影响小。缺点：分子易脱落。固常与其他方法结合使用，如吸附交联法。适用范围：酶膜和免疫分子膜的制作。图7.2.6吸附法示意图Slide14§7-2生物敏感膜与固定化技术7-2-2固定化技术制备方法：酶分子通过共价键与不溶性载体结合而固定。优点：结合牢固，蛋白质不易脱落；载体不易被生物降解；使用寿命长。缺点：操作繁琐，酶活性受影响。图7.2.7共价连接法示意图Slide15§7-2生物敏感膜与固定化技术7-2-2固定化技术酶蛋白上可供载体结合的功能基团有以下几种：（1）酶蛋白N末端的α-氨基或赖氨酸残基的ε-氨基。（2）酶蛋白C末端的α-羧基、天门冬氨酸残基的β-羧基以及谷氨酸残基的γ-羧基。（3）半胱氨酸残基的巯基。（4）丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基的羟基。（5）组氨酸残基的咪唑基。（6）色氨酸残基的吲哚基。（7）苯丙氨酸和酪氨酸残基的苯环。Slide16必须注意，参加共价结合的氨基酸残基应当是酶催化活性非必需基团，如若共价结合包括了酶活性中心有关的基团，会导致酶的活力损失。§7-2生物敏感膜与固定化技术7-2-2固定化技术制备方法：将酶分子或细胞包埋并固定在高分子聚合物三维空间网状结构基质中。优点：一般不产生化学修饰，对分子活性影响小；膜的孔径和形状可以任意控制；被包埋物不易渗漏；底物分子可在膜中任意扩散。缺点：分子量大的底物扩散困难。图7.2.8包埋法示意图Slide17§7-2生物敏感膜与固定化技术7-2-2固定化技术制备方法：依靠双功能试剂在分子间形成交联而聚成网状结构。优点：操作简单；结合牢固。缺点：固定化时需严格控制pH，交联剂浓度，否则会使蛋白质中毒，酶分子会部分失活。图7.2.9交联法示意图Slide18吸附法包埋法共价结合法交联法物理吸附法离子吸附法制备易易较难难较难结合程度弱中等强强强活力回收率高，但酶易流失高高低中等再生可能可能不可能不可能不可能固定化成本低低低高中等底物专一性不变不变不变可变可变表7.2.2各种固定化方法的比较§7-2生物敏感膜与固定化技术7-2-2固定化技术Slide19具体的例子让我们打开书295页，看书上表7.3Slide20特点：低温低压下制成高密度、分子排列方向一致的单分子层或双分子层超薄膜。典型的LB膜必须具有双亲性，即含有亲水基和疏水基的化合物。制备方法如图所示：§7-2生物敏感膜与固定化技术7-2-2固定化技术Slide21图7.2.10LB膜成膜方法§7-2生物敏感膜与固定化技术7-2-2固定化技术Slide22§7-2生物敏感膜与固定化技术7-2-2固定化技术Slide23固定化死细胞——只利用其酶活性；固定化活细胞——经固定化后，细胞仍保存活性，能进行正常的生长、繁殖和新陈代谢，所以称为固定化活细胞或固定化增殖细胞。固定化活细胞与固定化酶相比有何优越之处？都以酶的应用为目的，其制备方法也基本相同。固定化活细胞的制备条件比固定化酶更要温和，其制备方法主要有物理吸附法和包埋法两种。固定化活细胞保持了酶的原始状态，酶的稳定性更高，对污染的抵抗力更强；通常采用微生物细胞，生长力强，细胞多，反应快。以上仅举了固定化酶、固定化细胞的例子；实际上，根据感受器的不同，可以将生物传感器分成以下几种类型：◦酶传感器——固定化酶；◦微生物传感器——固定化细胞；◦免疫传感器——固定化抗原/抗体；◦……Slide24§7-2生物敏感膜与固定化技术7-2-2固定化技术下面我们从酶传感器开始，进一步为大家介绍上述生物传感器。Slide25§7-3酶传感器酶传感器的组成和工作原理：固定化酶膜：选择性地“识别”被检测的物质，并且催化被“识别”出的物质发生化学反应；变换器：把这一催化反应中底物或产物的变量转换成电信号，进而通过仪表显示出来。图7.3.1酶传感器的工作原理Slide26酶电极：在基础电极的敏感面上装有固定化酶膜，当电极插入待测溶液时，酶膜中的酶发生催化反应产生电极活性物质（如氧，过氧化氢，氨等），引起基础电极电位变化，转化成电信号，由此测出该酶所催化的反应中反应物或反应产物的浓度。根据酶电极的输出信号方式，可有电流型和电位型两类电极。•电流型：由催化反应有关物质的电极反应得到的电流来确定反映物质浓度。如氧电极，燃料电池型电极，过氧化氢电极等。•电位型：通过测量敏感膜电位来确定与催化反应有关的各种离子浓度。如氨电极，二氧化碳电极，氢电极等。§7-3酶传感器反应原理：反应过程：1．底物S由液相传质到传感器表面2．底物S通过透析膜3．底物S在液相与酶层中进行分配4．底物S在酶层中传质与反应5．反应产物粒子通过透析膜进入基础电极室6．反应产物粒子在基础电极上发生电荷转移反应7.3.1电流型生物传感器基本原理Slide27§7-3酶传感器我们以葡萄糖传感器为例，来介绍电流型生物传感器的基本原理。Slide28课本上例子（相同原理）：极谱式氧电极（Clark氧电极）原理：§7-3酶传感器实际应用举例：针状酶电极传感器Slide29§7-3酶传感器我们注意到，葡萄糖氧化酶电极、乳酸酶电极等多数酶电极，其反应式：其中，都需要分子氧参与氧化还原反应。那么如果在缺氧，或氧分压不断变化的环境下怎么办呢？§7-3酶传感器Slide307.3.2介体酶电极——以介体（Mediator）取代O2/H2O2在酶反应和电极间进行电子传递。这种传感器可以较好地解决前面所述的问题，而且能降低工作电位，缩短响应时间，提高酶电极的选择性和重现性。以二茂铁单羧酸（Fc）电极为例，介绍工作原理：Fc作为GOD的氧化剂，在酶反应与电极过程间迅速传递电子。参考文献：金利通等.羧酸二茂铁为介体的生物传感器的研究.华东师范大学学报,1995,2:60-64.§7-3酶传感器Slide317.3.3酶敏FET意义：传感器的微型化结构：在pHISFET基础上制备一层GOD膜。（pHISFET见书249页）原理：1）反应式：2）该反应使酶膜中的pH下降；3）白蛋白膜为对葡萄糖不敏感的参考膜。优点：仅需微量试液，目前已开发出一种经皮血糖测试系统。通过一个吸引槽从皮肤吸出微量经皮浸出液，即可测量。§7-3酶传感器Slide327.3.4光寻址电位传感器（LightAddressablePotentiometricSensor，LAPS）光寻址电位传感器（LAPS）的基本原理及其构造类似于离子敏场效应管（ISFET）。它们都是基于EIS（电解质溶液-绝缘体-半导体）结构的敏感器件。原理：LAPS利用调制光从正面或背面对EIS结构进行光照寻址，通过检测绝缘体表面不同光照部位的电势变化而实现对溶液中特定离子的浓度的检测。优点：1)通过光照LAPS的不同敏感部位，可实现多参数测量；2)稳定性好；3)易于封装；4)检测时间短。半导体参考文献：梁卫国等.光寻址电位传感器的机理研究.半导体光电,2001,22(3):184-187,210.微生物燃料电池(MFC)是一种以微生物为阳极催化剂，将化学能直接转化成电能的装置。利用MFC不仅可以直接将水中或者污泥中的有机物降解，而且同时可以将有机物在微生物代谢过程中产生的电子转化成电流，从而获得电能。目前MFC有以下几个应用：①MFC传感器—BOD（生化需氧量）传感器；②空间生物再生式生保系统中的应用；③替代能源;④污水处理新工艺。Slide33