第7章 转基因动物与动物生物反应器

11第七章第七章基因转导与转基因动物基因转导与转基因动物22在分子细胞学技术中，当一个基因被在分子细胞学技术中，当一个基因被克隆后，检测它的性状和功能，最好的办克隆后，检测它的性状和功能，最好的办法是把它导入到细胞中，观察它在细胞中法是把它导入到细胞中，观察它在细胞中的表达结果。把基因导入细胞中的技术称的表达结果。把基因导入细胞中的技术称基因转导基因转导(Genetransfer)(Genetransfer)。。一、基因转导的概念与方法选择一、基因转导的概念与方法选择33基因转导可在基因转导可在染色体染色体和和DNADNA大分子大分子((基因基因))两个水平两个水平上进行。上进行。染色体转导染色体转导是利用细胞融合是利用细胞融合或显微注射法把携有目的基因的染色体或染色或显微注射法把携有目的基因的染色体或染色体片段，导入受体细胞体片段，导入受体细胞((或称宿主细胞或称宿主细胞))内的技内的技术。而术。而基因转导基因转导是把已克隆的基因、含有目的是把已克隆的基因、含有目的基因的基因的DNADNA片段或序列等，导入受体细胞基因片段或序列等，导入受体细胞基因组中的技术。组中的技术。1.1.基因转导技术的种类基因转导技术的种类44根据根据受体细胞受体细胞的不同，基因转导分成两大类。的不同，基因转导分成两大类。一类是把基因导入一类是把基因导入体外培养细胞体外培养细胞中，观察目的基中，观察目的基因在体外细胞中的表达。这一技术习惯上称因在体外细胞中的表达。这一技术习惯上称基因基因转染转染(Genetransfection)(Genetransfection)。。另一类受体细胞是受另一类受体细胞是受精卵，向精卵，向受精卵或早期胚胎受精卵或早期胚胎内导入目的基因后，内导入目的基因后，再把受精卵置入宿主动物子宫、发育成个体，以再把受精卵置入宿主动物子宫、发育成个体，以观察基因在动物个体上的表达观察基因在动物个体上的表达，所得到的动物，所得到的动物个体称为个体称为转基因动物转基因动物(Transgenicanimal)(Transgenicanimal)。。55基因转导方法基因转导染色体转导细胞融合技术显微注射等基因转染（体细胞）转基因动物（生殖细胞）磷酸钙法脂质体法逆转录病毒电击法显微注射法2.基因转导的方法选择显微注射法逆转录病毒法胚胎干细胞转导法精子载体法细胞核移植法66▶▶融合法融合法：包括细胞融合、脂质体介导融合、原生质体介：包括细胞融合、脂质体介导融合、原生质体介导融合、微细胞介导融合、鬼影红细胞融合等；导融合、微细胞介导融合、鬼影红细胞融合等；▶▶化学法化学法：：DNADNA--磷酸钙共沉淀法、磷酸钙共沉淀法、DEAEDEAE--葡聚糖法等；葡聚糖法等；▶▶物理法物理法：显微注射、电脉冲、基因枪、细胞冷冻法等；：显微注射、电脉冲、基因枪、细胞冷冻法等；▶▶逆转录病毒感染法逆转录病毒感染法：重组：重组DNADNA病毒感染、重组病毒感染、重组RNARNA病毒病毒感染等；感染等；▶▶精子载体法精子载体法：通过体外受精或人工授精实现基因转移；：通过体外受精或人工授精实现基因转移；▶▶细胞核移植法细胞核移植法：基因转导的畸胎瘤细胞、胚胎干细胞、：基因转导的畸胎瘤细胞、胚胎干细胞、体细胞等作为供体细胞进行核移植得到转基因后代。体细胞等作为供体细胞进行核移植得到转基因后代。771.1.微小细胞融合介导的基因转导微小细胞融合介导的基因转导((染色体转导染色体转导))原理：原理：用细胞融合的方法，将微小细胞内用细胞融合的方法，将微小细胞内所含的染色体导入受体细胞中，实现染所含的染色体导入受体细胞中，实现染色体的转导。色体的转导。二、基因转导的技术方法二、基因转导的技术方法88应用微小细胞融合技术可将单个的、应用微小细胞融合技术可将单个的、未受损伤的染色体从一种细胞转导到另未受损伤的染色体从一种细胞转导到另一种细胞。应用这一技术得到的杂交细一种细胞。应用这一技术得到的杂交细胞，是胞，是研究基因定位、哺乳动物基因结研究基因定位、哺乳动物基因结构、表达、调控的理想模型构、表达、调控的理想模型。同时这一。同时这一方法和其它基因转导方法联合应用，对方法和其它基因转导方法联合应用，对分离鉴定肿瘤抑制基因及某些疾病基因分离鉴定肿瘤抑制基因及某些疾病基因是十分有用的技术。是十分有用的技术。99微小细胞介导的基因转移主要过程1010方法方法：：微小细胞融合介导基因转导技术主要涉微小细胞融合介导基因转导技术主要涉及以下步骤部分：及以下步骤部分：①①将选择性标志基因转导供体细胞将选择性标志基因转导供体细胞②②制备微小细胞制备微小细胞③③微小细胞与受体细胞融合微小细胞与受体细胞融合④④杂交细胞的筛选杂交细胞的筛选⑤⑤杂交细胞的鉴定杂交细胞的鉴定11112.2.磷酸钙共沉淀法磷酸钙共沉淀法原理原理：：一般认为，带正电荷的钙离子首先和一般认为，带正电荷的钙离子首先和DNADNA结合，当加入含磷酸根的缓冲液后导致形成结合，当加入含磷酸根的缓冲液后导致形成DNA/DNA/磷酸钙的沉淀微粒，这些微粒落到细胞磷酸钙的沉淀微粒，这些微粒落到细胞表面后被细胞内吞，从而将表面后被细胞内吞，从而将DNADNA带入细胞。带入细胞。转染用的外源转染用的外源DNADNA可用基因组可用基因组DNADNA或质粒或质粒((载体载体)DNA)DNA。。既可用单一基因转染，也可和另既可用单一基因转染，也可和另一种附加的、起标记或筛选作用的基因共同进一种附加的、起标记或筛选作用的基因共同进行转染。行转染。13133.DEAE3.DEAE葡聚糖转染法葡聚糖转染法原理：原理：DEAEDEAE葡聚糖是多聚阳离子化合葡聚糖是多聚阳离子化合物，能被用来吸附核酸并转染细胞，其物，能被用来吸附核酸并转染细胞，其转染机制可能是细胞对转染机制可能是细胞对DEAEDEAE葡聚糖葡聚糖/DNA/DNA复合物的内吞，从而使外源复合物的内吞，从而使外源DNADNA进入细胞并整合入细胞基因组中。进入细胞并整合入细胞基因组中。1414此法的转染效率可通过此法的转染效率可通过氯喹处理氯喹处理转染转染细胞得到改善。可能氯喹有中和转染细胞细胞得到改善。可能氯喹有中和转染细胞溶酶体溶酶体pHpH的作用，当细胞摄入外源的作用，当细胞摄入外源DNADNA后，能保护后，能保护DNADNA不被降解，从而能保证不被降解，从而能保证DNADNA进入核中。进入核中。与磷酸钙沉淀方法一样，转染后与磷酸钙沉淀方法一样，转染后用甘用甘油或油或DMSODMSO处理处理细胞能提高某些细胞系的细胞能提高某些细胞系的转染效率。转染效率。15154.4.脂质体介导转染法脂质体介导转染法原理原理：：脂质体试剂脂质体试剂((LipofectinLipofectinregeantregeant，，LR)LR)是阳是阳离子脂质体离子脂质体DOTMADOTMA(3(3--二油酰氧二油酰氧))丙基丙基]]--NN，，NN，，NN--氯化三甲铵氯化三甲铵))和和DOPEDOPE((二油酰磷脂酰乙醇胺二油酰磷脂酰乙醇胺))的混合物的混合物1:11:1，，它适用于把它适用于把DNADNA转染入悬浮或贴转染入悬浮或贴壁培养细胞中，是目前条件下最方便的转染方壁培养细胞中，是目前条件下最方便的转染方法之一。法之一。1616LRLR的阳离子部分可以吸附的阳离子部分可以吸附DNADNA，，使得使得LRLR能与能与DNADNA自发地形成自发地形成DNA/DNA/脂质体复合物，脂质体复合物，DNA/DNA/脂质体的电性脂质体的电性趋于正或中性趋于正或中性，有利于和，有利于和带负电性的细胞膜接近，同时脂质体的脂性部带负电性的细胞膜接近，同时脂质体的脂性部分能促进脂质体和细胞膜融合或被细胞内吞，分能促进脂质体和细胞膜融合或被细胞内吞，从而将从而将DNADNA带入细胞、整合入细胞基因组。带入细胞、整合入细胞基因组。LRLR中的中的DOPEDOPE能加强脂质体与细胞膜的能加强脂质体与细胞膜的融合，从而提高转染效率；并能使内吞体不稳融合，从而提高转染效率；并能使内吞体不稳定而释放内吞的定而释放内吞的DNA/DNA/脂质体复合物，有利于脂质体复合物，有利于DNADNA进入细胞核内。进入细胞核内。1717DNAliposome18185.5.电电转移转移(E1ectroporation)(E1ectroporation)原理：原理：把悬浮状态的受体细把悬浮状态的受体细胞和用于转染的胞和用于转染的DNADNA放置放置在两个电极之间，利用加在两个电极之间，利用加载到细胞上的电场的作载到细胞上的电场的作用，导致细胞膜通透性短用，导致细胞膜通透性短暂升高，使得周围液体中暂升高，使得周围液体中的大分子物质（如核酸）的大分子物质（如核酸）能通过细胞膜进入细胞中。能通过细胞膜进入细胞中。19196.6.基因枪基因枪将将核酸沉积到微小的金属粒子核酸沉积到微小的金属粒子（如金颗粒或钨颗粒）上，金（如金颗粒或钨颗粒）上，金属粒子的直径约为属粒子的直径约为11～～33mm，，利用特殊的基因枪，将上述金利用特殊的基因枪，将上述金属粒子加速并冲击细胞，从而属粒子加速并冲击细胞，从而将核酸带入细胞中。将核酸带入细胞中。该方法的优点是适用的细胞类该方法的优点是适用的细胞类型广泛，还能适用于组织和体型广泛，还能适用于组织和体内，能进行基因的瞬时表达和内，能进行基因的瞬时表达和永久表达。永久表达。20207.7.细胞显微注射转染法细胞显微注射转染法原理：原理：借助显微注射器直接把借助显微注射器直接把DNADNA注射入细胞注射入细胞核或细胞质内，使之整合入受体细胞基因组核或细胞质内，使之整合入受体细胞基因组中。中。前述技术是利用生物学媒介或改变生物膜前述技术是利用生物学媒介或改变生物膜性质，性质，使使DNADNA进入核内被整合入基因组中的方进入核内被整合入基因组中的方法；而细胞显微注射技术是通过直接注射的方法；而细胞显微注射技术是通过直接注射的方法使外源基因进入细胞。法使外源基因进入细胞。21213002μm2222细胞显微注射除适用于注射细胞显微注射除适用于注射DNADNA片片段、寡核苷酸，也可用于注射蛋白、抗段、寡核苷酸，也可用于注射蛋白、抗体以及各种对细胞有影响的药物等。体以及各种对细胞有影响的药物等。2323三、转基因动物三、转基因动物转基因动物转基因动物(trnasgenicanimal)：是指借用基因工程技术将外源基因导入动物染色体内，使外源基因与动物基因整合后随细胞的分裂而扩增，在动物体内表达并能稳定地遗传给后代的动物。生产转基因动物的方法主要有原核(显微)注射法、逆转录病毒感染法、胚胎干细胞介导法、精子载体导入法、细胞核移植法等，应用较多的方法为原核（显微）注射法。24241.1.转基因动物的研究历史转基因动物的研究历史19741974年，年，JaenishJaenish和和MintzMintz向小鼠囊胚注射向小鼠囊胚注射SV40SV40的的DNADNA，，在发育成的幼鼠体内检测到了在发育成的幼鼠体内检测到了SV40DNASV40DNA序列序列的存在。的存在。19761976年，年，JaenishJaenish通过逆转录病毒感染法，将通过逆转录病毒感染法，将SV40SV40病毒病毒DNADNA导入小鼠胚胎中，获得转基因小鼠。导入小鼠胚胎中，获得转基因小鼠。19801980年，年，GordonGordon等把等把SV40SV40以及以及HSVHSV的的TKTK基因整合后基因整合后的质粒注入小鼠受精卵原核中，培育出转基因小鼠。的质粒注入小鼠受精卵原核中，培育出转基因小鼠。19821982年、年、19831983年，年，PalmiterPalmiter等将等将MTMT--rGHrGH与与MTMT--hGHhGH导入小鼠，获得了导入小鼠，获得了““巨鼠巨鼠””，引起了生物学界的关注，，引起了生物学界的关注，为基因工程育种和研究基因表达提供了诱人的前景。为基因工程育种和研究基因表达提供了诱人的前景。252519851985年美国科学家