第2章 细胞生物学研究方法

1第二章细胞生物学研究方法一、显微成像技术二、细胞化学技术三、细胞分选技术四、细胞工程技术五、分离技术六、分子生物学方法2第一节显微成像技术1、光学显微镜1.1普通复式光学显微镜技术(图)原理(图)分辨率是指区分开两个质点间的最小距离(图)分辨率r=0.61λ/nsina最大分辨率蓝光λ=450nm,sin70°=0.94r=0.3μm(n=1),r=0.2μm(n=1.5)分辨极限与放大率光镜样本制作：样品固定、包埋、切片、染色(图)31.2常用的光学显微镜体视显微镜(图)相差显微镜和录相增差显微镜倒置显微镜(图)暗视野显微镜(图)荧光显微镜激光共焦点扫描显微镜技术42、电子显微镜(图)2.1电子显微镜的基本知识¡电镜与光镜的比较(图)电镜的分辨率0.2nm超微结构(亚显微结构)¡电子显微镜的基本构造(图)照明系统、成像系统、真空系统、记录系统2.2透射电子显微镜(TEM)z超薄切片技术(图)：细胞超微结构的观察技术用于电镜观察的样本制备示意图(图)固定、包埋、切片、染色为什么电子显微镜需要真空系统与LM相比,EM样品组织固定有什么特殊要求?5z负染色技术(Negativestaining)金属投影(图)染色背景，衬托出样品（病毒等）的精细结构（轮廓）z冰冻蚀刻技术（Freezeetching）（图）冰冻断裂、蚀刻、复型：作用：主要用来观察膜断裂面的蛋白质颗粒和膜表面结构。快速冷冻深度蚀刻技术(图)z电镜三维重构技术(图)膜蛋白、病毒以及蛋白质--核酸复合物等大的复合体的三维结构。62.3扫描电镜（SEM）z原理与应用(图)样品表面或断面的形貌特征的观察技术z电子“探针”扫描，激发样品表面放出二次电子(图)，探测器收集二次电子成象。z样品制备:取材,清洗,固定,脱水,干燥,粘样,喷金z环境扫描电镜¡显示生物样品的真实面貌¡观察常规扫描电镜较难处理的样品¡生物样品的X射线元素分析¡生物样品的活体观察2.4扫描遂道显微镜7第二节细胞化学技术一、酶细胞化学技术酶细胞化学技术就是通过酶的特异细胞化学反应来显示酶在细胞内的定位。二、免疫细胞化学技术(图)♣免疫荧光技术:对抗原进行细胞内定位♣免疫电镜技术:进行亚细胞结构和分子定位.8第三节细胞分选技术一、流式细胞仪的基本原理(图)应用:对细胞或染色体进行分选,并对单个细胞或其他生物微粒进行定量分析,包括测量细胞的大小、形状、细胞DNA、RNA含量和细胞总蛋白等。二、分选(图)9第四节细胞工程技术细胞工程(cellengineering)：利用细胞生物学的原理和方法，结合工程学的技术手段，按照人们预先的设计，有计划地改变或创造细胞遗传的技术。一、细胞培养细胞培养(cellculture)：在体外模拟体内的生理环境，培养从机体中取出的细胞，并使之生存和生长的技术。1、动物细胞培养(图)2、植物组织培养(图)10二、细胞融合与单克隆抗体技术1、细胞融合(图)2、单克隆抗体技术(图)3、显微操作术(图)三、动物细胞核移植克隆技术(图)11第五节分离技术1、离心分离技术用途：分离细胞器与生物大分子及其复合物类型：z差速离心：分离密度不同的细胞组分(图)z密度梯度离心：精细组分或生物大分子的分离(图)2、层析分离技术凝胶过滤层析亲和层析离子交换层析离子交换层析的原理是什么?12第六节分子生物学方法1、基因工程技术(图)2、基因作图与人类基因组计划3、PCR技术4、选择性基因剔除与转基因鼠(图)5、乳腺生物反应器技术(图)13CompoundLightMicroscope14PartsofaNikoncompoundmicroscope.1516图3-1-1显微镜成像原理AB：被检物体L1：物镜A1B1：倒立实像L2：目镜A2B2：放大的倒立虚像L3：眼球晶状体A3B3：视网膜上正立像F1，F2：分别是物镜和目镜的焦平面17181920相差显微镜技术¡相差显微镜（phase-contrastmicroscope）将光程差或相位差转换成振幅差，可用于观察活细胞(图)¡录像增差显微镜技术（video-enhancemicroscopy）(图)计算机辅助的DIC显微镜可在高分辨率下研究活细胞中的颗粒及细胞器的运动212223„相差聚光器：向显微镜提供环状光源„相差物镜：物镜的后焦点平面处装有相板，分为两部分，一部分可通过直射光，为半透明的环状，叫共轭面，另一部分可通过衍射光，叫补偿面。„相板上通常有吸收膜和相位膜，吸收膜吸收光线，降低光透过率；相位膜推迟相位。„相差滤色镜24应用：无色透明活体标本的细微结构，检查,鉴定活体细胞(培养细胞,分离细胞)2526倒置显微镜主要应用：集光器与载物台之间工作距离较高，可以放置培养皿、培养瓶等容器，直接对培养的细胞进行照明和观察。2728主要应用：主要观察的是物体的轮廓，分辨不清内部的微细胞构造，适合于观察活细胞内的细胞核、线粒体、液体介质中的细菌和霉菌等。原理：丁道尔现象，微粒对斜射光反射或衍射，增大了人眼可见性。29荧光显微镜技术（FluorescenceMicroscopy)原理(图）应用(图）¡直接荧光标记技术¡间接免疫荧光标记技术¡主要应用：研究细胞内物质的吸收、运输以及化学物质的分布及定位等。30宽谱线发射光（汞灯）滤掉其他光，透过激发光滤掉激发光，透过荧光标本受激发产生荧光向四周发散激发光受反射、折射或衍射向四周发散313233激光共焦点扫描显微镜技术(LaserScanningConfocalMicroscopy）原理(图)应用：¡排除焦平面以外光的干扰，增强图像反差和提高分辨率(1.4-1.7)¡可重构样品的三维结构。34XYZ细胞标本35363738电子显微镜的基本构造394041Examplesofnegativelystainedandmetal-shadowedspecimens.Electronmicrographsofatobaccorattlevirusafternegativestainingwithpotassiumphosphotungstate(a)orshadowcastingwithchromium(b).424344454647¡ScanningProbeMicroscope,SPM80年代发展起来的检测样品微观结构的仪器,包括：STM、AFM、磁力显微镜、摩擦力显微镜等¡原理：扫描探针与样品接触或达到很近距离时，即产生彼此间相互作用力，如量子力学中的隧道效应（隧道电流）、原子间作用力、磁力、摩擦力等，并在计算机显示出来，从而反映出样品表面形貌信息、电特性或磁特性等。(图)¡特点：(1)可对晶体或非晶体成像，无需复杂计算，且分辨本领高。（侧分辨率为0.1～0.2nm，纵分辨率可达0.01nm）；(2)可实时得到样品表面三维图象，可测量厚度信息；(3)可在真空、大气、液体等多种条件下工作；非破坏性测量。(4)可连续成像，进行动态观察¡用途纳米生物学研究领域中的重要工具,在原子水平上揭示样本表面的结构。如DNA、RNA和蛋白质等生物大分子及生物膜、病毒等的结构。4849505152细胞标记53染色体标记545556植物组织培养57•植物原生质体培养5859606162636465666768基因敲除69