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第三章实验动物微生物学•实验动物微生物质量控制是实验动物标准化的主要内容之一，按微生物控制标准，或根据微生物净化程度，实验动物在我国分为四类：•1、普通级动物（CV）亦称一级动物；•2、清洁级动物（CL）亦称二级动物；•3、无特定病原体动物（SPF）亦称三级；•4、无菌及悉生动物（GF、GA）亦称四级动物。实验动物质量国家标准•对实验动物等级进行了重新设定，与寄生虫学等级相对应，将实验小鼠和大鼠的微生物学等级分为清洁级、无特定病原体级（SPF）和无菌级。豚鼠、地鼠和家兔仍保持四级。犬和猴分为普通级和SPF级。实验动物微生物等级的设定•小鼠清洁级SPF级无菌级•大鼠清洁级SPF级无菌级•地鼠普通级清洁级SPF级无菌级•豚鼠普通级清洁级SPF级无菌级•家兔普通级清洁级SPF级无菌级•犬普通级SPF级•猴普通级SPF级•根据微生物控制要求不同，其饲养环境各不相同。•普通级动物通常饲养在开放系统；•清洁级动物和无特定病原体动物饲养于屏障系统，•无菌动物和悉生动物饲养于隔离系统。第一节微生物与寄生虫学分类一、普通动物（Conventionalanimals,CV)•（一）基本概念•普通级动物是在微生物学控制上要求最低的实验动物。它要求不携带人兽共患病和动物烈性传染病的病原。因为普通级动物饲养在开放系统中，动物体内外所携带的微生物和寄生虫很难控制。•（二）特性及应用•1、微生物学特性；该类动物是在微生物控制上要求最低的动物。饲养管理中须采取一定的防护措施。限制无关人员进入动物室。国家标准中对动物室温度、湿度、风速等有的要求。•2、普通级动物的生理学特性：普通级动物应具有健康动物的外貌，正常的饮食，粪便与尿液外观与气味，毛色光泽、皮肤有弹性，行动无异常，体表淋巴结不肿大，眼角及鼻孔周围无分泌物附着，肛门及后躯清洁。解剖时动物的肝、肺、淋巴结正常，心、肝、脾、肺、肾、脑、生殖器等无眼观病灶。•3、应用•由于普通级动物是实验动物微生物控制要求较低的一类动物，对实验结果的准确性和反应性较差，因而国际上普遍认为仅可作为生物医学教学使用，或作为某些科研为探索方法而从事的予试验之用，不可供科研、生产和检定之用。二、清洁级动物(Cleananimals,CL)•（一）基本概念•除普通级动物应排除的病原体外，不携带对动物危害大和对科学研究干扰大的病原。这类动物称做清洁级动物。•清洁级动物的种群来源于SPF动物或无菌动物的剖腹产动物。•（二）特点和应用•清洁级动物比普通级动物要求排除的微生物和寄生虫多，但比SPF动物少。清洁级动物除肉眼观察无病外，尸体解剖时主要脏器、组织均无肉眼和组织学病变。•清洁级动物饲养于温湿度恒定的万级空气净化的屏障系统中；其饲料、垫料、笼器具等都经过消毒灭菌处理；饮用水采用高压灭菌水或Ph2.5--2.8的酸化水；工作人员需换灭菌工作服、鞋、帽、口罩等进入动物室进行操作。三、无特定病原体动物（Specificpathogenfreeanimals,SPF)•（一）基本概念•无特定病原体动物或称SPF动物，是指动物体内无特定的微生物和寄生虫存在，但允许携带非特定微生物的动物。•SPF动物除一、二级动物应排除的病原体外，不携带主要潜在感染、条件致病和对研究实验干扰大的病原。•SPF动物来源于无菌动物；•必须饲养在屏障系统中，实行严格的微生物控制。••结合我国的实情，以既排除对动物群有危害的病原体，又排除对实验研究有干扰的微生物和寄生虫为原则。卫生部对SPF动物规定应排除的细菌和病毒种数为：•小鼠大鼠豚鼠兔猫犬猴•细菌19181616233•病毒171374666•寄生虫无体内外所有寄生虫•（二）应用•目前国际上公认SPF动物适用于所有科研实验，是国际标准级别的实验动物。它的应用价值在于它无人畜共患病，无主要传染病，无对实验研究可能产生干扰的微生物。四、无菌动物和悉生动物Germfreeanimal,GFGnotobioticanimal,GN（一）基本概念•1、无菌动物：•是指不能检出一切生命体的动物。•即用现有的检验技术在动物体内外的任何部位均检不出任何活的微生物和寄生虫的动物，称为无菌动物。无菌动物来源于剖腹产或无菌卵的孵化，饲养于隔离系统内。•无菌动物是一个相对的概念，只是根据现有的科学知识和检验方法在一定时期内不能检出病原体而已。随着科学技术的发展，现在认为是无菌的动物或许将来可以检出病原体而不是无菌动物。•另外，无菌动物必须是生来就是无菌动物。若用大量抗菌素也可使普通动物暂时无菌，但这种动物不是无菌动物，因为这种无菌状态是一时性的，某些残留的细菌在适当的条件下又会在体内增殖,而且，它们给动物造成的影响是无法消除的。如特殊性抗体的存在、网壮内皮系统的活化、某些组织或器官的病理变化等。•2、悉生动物：•又称已知菌动物或已知菌丛动物。它是指在无菌动物体内人为植入一种或数种微生物的动物。依植入菌种数目的不同，又分为单菌、双菌、多菌动物。饲养管理与无菌动物相同。GN动物也必须饲养在隔离器内，其区别是隔离器内带有某一种或几种已知菌。（二）特点•无菌动物和普通动物的外观和活动之间看不出有特别的差异，有时仅见有体重增加，但是，其功能、结构和普通动物有很大不同。主要有以下两方面的特点：无菌动物的特点：•1、形态学的改变•消化系统•血液循环系统•免疫系统•泌尿系统•2、生理学变化：•免疫功能：•生长和生殖：•代谢：•营养：•寿命•消化系统：无菌动物肠道肌层薄，盲肠肥大，比普通动物大5--6倍，常易导致盲肠扭转或肠壁破裂而死亡。•肝脏重量相对下降，导致解毒功能有所下降。•泌尿系统：肾脏较小。•血液循环系统：无菌动物心脏相对缩小，白细胞增加。•免疫系统：胸腺网状上皮细胞体积较大。无菌兔胸腺功能不活跃，脾脏缩小，网状内皮细胞功能下降。无菌动物免疫功能基本上处于原始状态。••生理学变化：•免疫功能：产生丙种球蛋白的能力弱，血中无抗体，血清杀菌力低，对微生物感染异常敏感。•生长率：无菌鸟类生长率高于普通鸟，无菌豚鼠和无菌兔比普通的慢。•生殖：无菌条件对动物的生殖影响不大。•代谢：血中含氮量少，代谢周期比普通动物长。•营养：无菌动物体内不能合成维生素B和K。•抗辐射能力：无菌动物抗辐射能力强。•寿命：无菌动物的寿命普遍长于普通动物。•悉生动物的特点：•悉生动物来源于无菌动物，体内有已知种类的几种微生物定居，形成动物和微生物的共生复合机体。悉生动物的生活力较强，抵抗力明显增强。易于饲养管理，在有些实验中可作为无菌动物的代用动物。（三）无菌动物和悉生动物的应用•1、动物模型研究•无菌动物可用于建立具有人正常菌丛或致病菌丛的动物模型。•2、老年病研究•无菌动物较正常动物寿命长，提示微生物的存在与机体衰老有关。因而无菌动物可能在衰老机理的研究中发挥重要作用。•3、免疫学研究•无菌动物血中无特异性抗体，因而适合有关免疫现象的研究。免疫抑制剂常以无菌动物作研究。应用悉生动物可研究正常菌群在维持机体适当特异性免疫性和非特异性免疫反应所具有的刺激作用，以探讨自然抵抗力的机制以及有关抗原作用后免疫力产生和发展的过程，无菌动物和悉生动物的诞生大大加速了免疫学的进程。•4、肿瘤研究•无菌动物在肿瘤发生与微生物的关系以及致癌物质的致癌作用研究中有重要作用。•5、药理与毒理研究•观察发现普通豚鼠对青霉素的敏感性高于无菌豚鼠。普通动物进食大豆易中毒，无菌动物则不会。提示某些物质的毒理作用常与肠道微生物代谢有关。无菌动物适用于慢性毒性实验。•6、其它•无菌动物和悉生动物可用于传染病学、放射生物学、微生物学、营养学、宇航医学等许多领域的研究。将培养无菌动物的原理和技术应用于临床，能有效地控制感染。第六节五、洁净动物与普通动物的特性比较•洁净动物通常是指来源于剖腹产、实行严格的微生物控制、饲养于空气净化系统设施内的动物；包括清洁动物、SPF动物、悉生动物和无菌动物。洁净动物与普通动物相比，在很多方面存在差异。•（一）微生物控制比较•由于动物分类等级不同，其微生物控制程度也不一致，与之相对应的动物饲养环境及饲养管理方法也各不相同。•种类饲育环境说明•无菌动物隔离系统无法检出任何生命体•悉生动物隔离系统确知代有的微生物•SPF动物屏障系统确知不带有的微生物•清洁动物屏障系统确知不带有的微生物•普通动物开放系统对微生物带有情况不明确•（二）对科研实验结果影响的比较•普通动物体内携带大量寄生体，其中有致病的，非致病的，参与机体的新陈代谢，与机体构成生命复合体。用这些动物做实验，势必受未知寄生体的干扰，难于观察生命的基本活动规律。•洁净动物由于有明确的微生物背景和可控的饲育环境，可大大提高动物试验的重复性和正确性，因而得到广泛的应用。•无菌动物SPF动物清洁动物普通动物•传染病无无无有或可能有•试验结果明确明确明确有疑问•用动物数少量少量较少多或大量•统计价值很好可能好较好不准确•长期实验好好可能好困难•死亡率很少少较少高•长期实验成活率约100%约90%约80%约40%•实验标准设计可能可能可能不可能•结果讨论价值很高高较高有疑问•（三）生物学特性的比较•洁净动物与普通动物相比，在血液学、血液生化指标及主要脏器系数方面均产生一定变化。•如清洁级大鼠与普通大鼠相比，白细胞较少，其中中性粒细胞少，淋巴细胞相对增加；血清碱性磷酸酶、胆红素、胆固醇值较高；尿素氮、肌酐值比较低；空肠淋巴结、脾脏较轻；肺、肾组织形态比普通大鼠健康。第二节实验动物常见感染性疾病一、实验动物的病毒感染•1、鼠痘病毒（小鼠脱脚病）•2、流行性出血热病毒•3、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒•4、兔出血症病毒（兔瘟）•5、狂犬病病毒•6、猴疱疹病毒（B病毒）（一）鼠痘•鼠痘是由鼠痘病毒所引起的小鼠的急性传染病。急性引起大批死亡，亚急性或慢性使患鼠肢尾肿胀，发炎和坏疽脱落呈“缺肢”的畸形，即为其主要特征。•临床症状：•急性型：小鼠绝食、昏睡、被毛逆立松乱、头颈肿胀，结膜炎，很快死亡，死亡率60%--90%。•亚急性和慢性：小鼠皮肤出现皮疹，发生溃烂、坏死，形成坏疽，最后四肢及尾部断裂脱落。病情较长•诊断：•根据临床症状可作初步诊断，然后依据病理学诊断，检查包涵体、动物实验、电镜检查、病毒分离、血清学诊断等进行确诊。•预防：•经常进行检测。外来人员严禁进入动物室。（二）流行性出血热（EHF)•流行性出血热（epidemichemorrhagicfever)；是由流行性出血热病毒引起的，主要发生在大鼠的烈性传染病，也是一种人畜共患病。•主要特征：高热、出血性肾功能损害。故又名肾综合征出血热（HemorrhagicFeverwithRehalSyndrome,HFRS)•病原学：病毒属于布尼亚病毒科，汉坦病毒。本病毒对紫外线敏感。•流行病学：自然宿主是小型啮齿动物，大鼠是实验动物的主要传染源。人类主要由于接触带病毒的宿主动物及其排泄物而受感染。•该病一种自然疫源性疾病，主要在野鼠中流行，隐性感染为主，黑线姬鼠、长爪沙鼠对本病特别敏感，实验大、小鼠、豚鼠、家兔均可感染。多数成年啮齿类动物感染后无症状，但病毒可由动物传染给人，人主要是通过含有病毒的血、尿和污染皮肤破损处或由革螨等昆虫传播。通过粉尘气溶胶吸入感染是主要的传播途径。•临床症状：HFRS的潜伏期14天，它是一种对实验人员危害较大的人畜共患传染病。当人感染后以发热、头疼、肌肉痛、充血、出血、休克、急性肾功能衰竭为主要特征，死亡率较高。所以，应引起实验人员的高度注意。•诊断：根据临床症状和病理变化作出初诊，确诊需要病原学和血清学诊断。•预防：1、综合性预防措施：鼠群实行定期血清学检查检查；加强管理，防止饲料、垫料污染；加强防护，消灭野鼠，防止野鼠进入实验室污染是防本病的主要措施，实验人员防止被鼠咬伤。2、疫苗接种。（三）淋巴细胞性脉络丛脑膜炎•淋巴细胞性脉络丛脑膜炎（lymphocyticchoriomeningitisLCM）是由淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒引起的急性传染病，是呈多样表现的一种人畜共患病。主要侵害中枢神经系统，呈现脑膜炎症状。•动物多呈隐性感染，少数发病出现急性