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第三章细胞生物学研究方法第四节细胞培养与细胞工程一、细胞培养•在体外模拟体内的生理环境，培养从机体中取出的细胞，并使之生存和生长的技术。•体外细胞培养注意的几个环节：•1、物质营养：培养基•2、生存环境：无菌环境、合适的温度、一定的渗透压和气体环境•3、废物的排出：定时换培养基•原代培养（primaryculture）：直接从机体取下细胞、组织和器官后立即进行培养。•将细胞转移到新的容器中培养称为传代或传代培养（passage）。（一）动物细胞培养组织块培养；分散细胞培养。•细胞系（cellline）：原代培养细胞成功传代即为细胞系。•克隆（clone）：亦称无性系。指由同一个祖先细胞通过有丝分裂产生的遗传性状一致的细胞群。•细胞株（cellstrain）：从培养细胞中筛选出的具有特定性质或标志的细胞群。原代培养(primaryculture)传代培养(secondaryculture)传代细胞系（Cellline）成功筛选细胞株（cellstrain）表三、实验室中常用的几种细胞系细胞系名称细胞类型来源3T3成纤维细胞小鼠HeLa宫颈癌上皮细胞HenriettaLacksBHK21成纤维细胞叙利亚仓鼠PtKl上皮细胞袋鼠L6成肌细胞大鼠PCI2嗜铬细胞大鼠SP2浆细胞小鼠SP2／0骨髓瘤浆细胞小鼠CHO卵巢细胞中国地鼠HenriettaLacks,Americanblack,diedofcancerofuterinecervixin1951（二）植物细胞培养1.单倍体培养：通过花药或花粉培养可获得单倍体植株。2.原生质体培养：培养脱壁后的细胞，特点：–①比较容易摄取外来的遗传物质，如DNA；–②便于进行细胞融合，形成杂交细胞；–③适宜条件下可产生细胞壁，经诱导分化成完整植株。二、细胞工程1、细胞融合2、单克隆抗体3、显微操作1、细胞融合•通过培养和介导，两个或多个细胞合并成一个双核或多核细胞的过程称为细胞融合（cellfusion）或细胞杂交。•同核体：相同基因型的细胞融合而成。•异核体：不同基因型的细胞融合而成。•自发融合：同种细胞在培养过程中自发合并的现象。•诱发融合：异种间的细胞必须经诱导剂处理才能融合。•诱导细胞融合的方法：生物方法（仙台病毒、副流感病毒和新城鸡瘟病毒）、化学方法（聚乙二醇PEG）、物理方法（电击和激光）。•B淋巴细胞能分泌特异抗体，但不能长期培养，瘤细胞可以在体外长期培养，但不分泌特异抗体。于是Kohler和Milstein1975将两种细胞杂交而创立了单克隆抗体技术，获1984年诺贝尔奖。2、单克隆抗体技术单克隆抗体技术3、显微操作技术micromanipulationtechnique•是在倒置显微镜下利用显微操作器进行细胞或早期胚胎操作的一种方法。•包括细胞核移植、显微注射、胚胎移植以及显微切割等。–细胞核移植技术已有几十年的历史，1952年，Briggs和King等将不同阶段的蛙胚细胞核注入去核的蛙卵，构建核移植胚。Gordon（1962）证明原肠胚以后的细胞核移植能发育到成体。1997年，Wilmut等克隆了绵羊Dolly。显微操作仪转基因显微操作过程密度梯度离心分离溶酶体、线粒体和微体CsCl密度梯度离心分离DNA