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第10章真核生物基因表达的调控本章教学要求1.熟悉真核基因组的结构特点、真核生物在DNA水平、转录水平和翻译水平上基因表达调控的特点。2.掌握以下概念：顺式作用元件、反式作用因子、启动子、增强子，熟悉沉默子、基本转录因子、特异转录因子。3.了解转录因子的结构特点。本章教学重点和难点1、真核生物在DNA水平和转录水平基因表达调控的特点。2、转录因子的结构特点。教学方法与手段讲授与交流互动相结合，采用多媒体教学。授课内容10.1真核生物基因表达调控的特点和种类一、真核生物基因表达调控的特点原核生物的调控系统就是要在一个特定的环境中为细胞创造高速生长的条件，或使细胞在受到损伤时，尽快得到修复，所以，原核生物基因表达的开关经常是通过控制转录的起始来调节的。真核基因表达调控的最显著特征是能在特定时间和特定的细胞中激活特定的基因，从而实现预定的、有序的、不可逆转的分化、发育过程，并使生物的组织和器官在一定的环境条件范围内保持正常功能。真核生物基因表达调控与原核的共同点：•基因表达都有转录水平和转录后的调控，且以转录水平调控为最重要；•在结构基因上游和下游、甚至内部存在多种调控成分，并依靠特异蛋白因子与这些调控成分的结合与否调控基因的转录。真核生物基因表达调控与原核的不同点：1、真核基因表达调控的环节更多：转录与翻译间隔进行，具有多种原核生物没有的调控机制；个体发育复杂，具有调控基因特异性表达的机制。2、真核生物活性染色体结构的变化对基因表达具有调控作用：DNA拓扑结构变化、DNA碱基修饰变化、组蛋白变化；3、正性调节占主导，且一个真核基因通常有多个调控序列，需要有多个激活物。二、真核生物基因表达调控的种类根据其性质可分为两大类：一是瞬时调控或称为可逆性调控，它相当于原核细胞对环境条件变化所做出的反应。瞬时调控包括某种底物或激素水平的升降，及细胞周期不同阶段中酶活性和浓度的调节。二是发育调控或称不可逆调控，是真核基因调控的精髓部分，它决定了真核细胞生长、分化、发育的全部进程。根据基因调控在同一事件中发生的先后次序又可分为：–DNA水平调控Replicationalregulation–转录水平调控transcriptionalregulation–转录后水平调控posttranscriptionalregulation–翻译水平调控translationalregulation–蛋白质加工水平的调控regulationofproteinmaturation10.2真核生物DNA水平上的基因表达调控一、基因丢失二、基因扩增三、基因重排四、DNA的甲基化与基因调控五、染色质结构与基因表达调控一、基因丢失•丢失一段DNA或整条染色体的现象。•在细胞分化过程中，可以通过丢失掉某些基因而去除这些基因的活性。某些原生动物、线虫、昆虫和甲壳类动物在个体发育中，许多体细胞常常丢失掉整条或部分的染色体，只有将来分化产生生殖细胞的那些细胞一直保留着整套的染色体。•目前，在高等真核生物（包括动物、植物）中尚未发现类似的基因丢失现象。图马蛔虫受精卵的早期分裂•马蛔虫2n＝2，但染色体上有多个着丝粒。第一次卵裂是横裂，产生上下2个子细胞。第二次卵裂时，一个子细胞仍进行横裂，保持完整的基因组，而另一个子细胞却进行纵向分裂，丢失部分染色体。图小麦瘿蚊的染色体丢弃瘿蚊卵跟果蝇相似（始核分裂胞质不分裂），其卵的后端含有一种特殊的细胞质极细胞质核→保持了全部40条染色体→生殖细胞其他细胞质区域核→丢失32条、留8条→体细胞二、基因扩增•基因扩增是指某些基因的拷贝数专一性增大的现象，它使得细胞在短期内产生大量的基因产物以满足生长发育的需要，是基因活性调控的一种方式。•如非洲爪蟾卵母细胞中rDNA的基因扩增是因发育需要而出现的基因扩增现象。发育或系统发生中的倍性增加在植物中普遍存在基因组拷贝数增加，即多倍性，在植物中是非常普遍的现象。基因组拷贝数增加使可供遗传重组的物质增多，这可能构成了加速基因进化、基因组重组和最终物种形成的一种方式。三、基因重排•将一个基因从远离启动子的地方移到距它很近的位点从而启动转录，这种方式被称为基因重排。•通过基因重排调节基因活性的典型例子是免疫球蛋白结构基因的表达。•在人类基因组中，所有抗体的重链和轻链都不是由固定的完整基因编码的，而是由不同基因片段经重排后形成的完整基因编码的。•完整的重链基因由VH、D、J和C四个基因片断组合而成。•完整的轻链基因由VL、J和C3个片段组合而成。人类基因组中抗体基因片断产生免疫球蛋白分子多样性的遗传控制重链和轻链的不同组合，κ、λ、H；在重链中，V、D、J和C片段的组合；κ轻链中V和C的组合；λ轻链中V、J和C的组合；基因片段之间的连接点也可以在几个bp的范围内移动。因此，可以从约300个抗体基因片段中产生109数量级的免疫球蛋白分子。四、DNA的甲基化与基因调控1、DNA的甲基化•胞嘧啶被甲基化修饰形成5-甲基胞嘧啶(mC)•几乎所有的mC与其3’的鸟嘌呤以5’mCpG3’的形式存在。•当两条链上的胞嘧啶都被甲基化时称为完全甲基化。•一般在复制刚完成时，子链上的C呈非甲基化状态，称为半甲基化。•在真核生物中，5-甲基胞嘧啶主要出现在CpG序列、CpXpG、CCA/TGG和GATC中•CpG二核苷酸通常成串出现在DNA上，CpG岛甲基化位点的检测•特殊的限制性内切酶——同裂酶•HpaⅡ识别并切割未甲基化的CCGG(C↓CGG)•MspⅠ识别无论是否甲基化的CCGG(C↓CGG或C↓CmGG)真核生物细胞内存在两种甲基化酶活性：•构建性甲基转移酶：作用于非甲基化位点，对发育早期DNA甲基化位点的确定起重要作用。•维持性甲基转移酶：作用于半甲基化位点，使子代细胞具备亲代的甲基化状态。•在一些不表达的基因中，启动区的甲基化程度很高，而处于活化状态的基因则甲基化程度较低。2.亲本印记(imprinting)•印记:来源于父母本的一对等位基因表达不同。如源于父本的IGF-Ⅱ(胰岛素样生长因子Ⅱ)基因可表达，而源于母本的则不能表达。这是由于卵母细胞中的IGF-Ⅱ已被甲基化，而精子中的IGF-Ⅱ未被甲基化，所以这一对等位基因在合子中表现不同。•目前在人类和鼠身上已辨明了20种印迹基因。大多数人类的印迹基因集中在三个簇中。在每个基因簇上都存在着特异的印记盒(imprintingbox)，能顺式调节印迹基因的亲本特异性表达，这些位点表现出亲本特异性的甲基化作用和去甲基化作用。3、DNA甲基化抑制基因转录的机理DNA甲基化导致某些区域DNA构象变化，从而影响了蛋白质与DNA的相互作用，抑制了转录因子与启动区DNA的结合效率。五、染色质结构与基因表达调控（一）活性染色质•按功能状态的不同可将染色质分为活性染色质和非活性染色质：•活性染色质是指具有转录活性的染色质；•非活性染色质是指没有转录活性的染色质。•真核细胞中基因转录的模板是染色质而不是裸露的DNA，因此染色质呈疏松或紧密结构，即是否处于活化状态是决定RNA聚合酶能否有效行使转录功能的关键。活性染色质的主要特点•在结构上：•活性染色质上具有DNaseI超敏感位点•活性染色质上具有基因座控制区•活性染色质上具有核基质结合区（MAR序列）活性染色质上具有DNaseI超敏感位点。每个活跃表达的基因都有一个或几个超敏感位点，大部分位于基因5´端启动子区域。活性染色质上具有核基质结合区（matrixattachmentregion，MAR）。MAR一般位于DNA放射环或活性转录基因的两端。在外源基因两端接上MAR，可增加基因表达水平10倍以上，说明MAR在基因表达调控中有作用。是一种新的基因调控元件。（二）活性染色体结构变化1、对核酸酶敏感活化基因常有超敏位点，位于调节蛋白结合位点附近。2、DNA拓扑结构变化•天然双链DNA均以负性超螺旋构象存在；•基因活化后3、DNA碱基修饰变化–真核DNA约有5%的胞嘧啶被甲基化，–甲基化范围与基因表达程度呈反比。4、组蛋白变化①富含Lys组蛋白水平降低②H2A,H2B二聚体不稳定性增加③组蛋白修饰：高乙酰化④H3组蛋白巯基暴露10.3真核生物转录水平上的基因表达调控一、真核生物与原核生物转录调控的差异1.真核生物转录过程涉及复杂的染色质结构变化；2.原核生物调节元件种类少，真核很多；3.原核生物有操纵子结构，真核不组成操纵子；4.大多数真核生物启动子以正调控为主，原核生物以负调控为主。“基因”的分子生物学定义：产生一条多肽链或功能RNA所必需的全部核苷酸序列。二、真核生物转录调控顺式作用元件（cis-actingelement）定义：影响自身基因表达活性的非编码DNA序列。例：启动子、增强子、沉默子等1、启动子：在DNA分子中，RNA聚合酶能够识别、结合并导致转录起始的序列。2、增强子指能使与它连锁的基因转录频率明显增加的DNA序列。SV40的转录单元上发现，转录起始位点上游约200bp处有两段长72bp的正向重复序列。增强子特点：①增强效应十分明显，一般能使基因转录频率增加10-200倍②增强效应与其位置和取向无关，不论增强子以什么方向排列（5‘→3’或3‘→5’），甚至和靶基因相距3kb，或在靶基因下游，均表现出增强效应；③大多为重复序列，一般长约50bp，适合与某些蛋白因子结合。其内部常含有一个核心序列：（G）TGGA/TA/TA/T（G），该序列是产生增强效应时所必需的；④增强效应有严密的组织和细胞特异性，说明增强子只有与特定的蛋白质（转录因子）相互作用才能发挥其功能；⑤没有基因专一性，可以在不同的基因组合上表现增强效应；⑥许多增强子还受外部信号的调控，如金属硫蛋白的基因启动区上游所带的增强子，就可以对环境中的锌、镉浓度做出反应。3、沉默子某些基因含有负性调节元件——沉默子，当其结合特异蛋白因子时，对基因转录起阻遏作用。三、反式作用因子（转录因子，transcriptionfactor）（一）定义能直接或间接地识别或结合在各类顺式作用元件上，参与调控靶基因转录的蛋白质,也称为转录因子（transcriptionalfactor，TF）。如：TFⅡD（TATA）、CTF（CAAT）、SP1(GGGCGG)、HSF(热激蛋白启动区)反式作用因子识别/结合顺式作用元件中的靶序列启动转录例：转录因子TFⅡD识别结合TATAbox转录因子SP1识别结合GCbox转录因子CTF1识别结合CCAATbox（二）反式作用因子的类型1.基本转录因子（通用转录因子）又称TATA盒结合蛋白，如TFⅠ、TFⅡ和TFⅢ等。与RNApolII相关的基本转录因子基本转录因子（通用转录因子）2.组织或细胞特异性转录因子EF1因子红细胞Isl-I因子胰岛β细胞MyoDI因子骨骼肌细胞NF-κB因子B淋巴细胞DF3因子乳腺癌细胞CEA启动子结合蛋白CEA阳性的肿瘤细胞3.可诱导（inducible）的转录因子热休克转录因子（HSTF）高温环境cAMP效应元件结合蛋白(CREBF)cAMP血清应激因子（SRF）血清中的生长因子CD28反应元件结合蛋白抗原激活蛋白2(AP-2)感染与炎症反应（三）转录因子上的几种重要结构域•反式因子有两个必需的结构域1、DNA结合结构域–螺旋-转折-螺旋（Helix-turn-helix，H-T-H）–锌指结构（zincfinger）–碱性-亮氨酸拉链（basic-leucinezipper）–碱性-螺旋-环-螺旋（basic–helix/loop/helix，bHLH）•螺旋-转角-螺旋（helix-turn-helix，HTH）•HTH的基本结构是两个α螺旋被一个转角结构分开。•α螺旋由短肽链组成，肽链的氨基酸顺序因不同的转录因子而不同。•其中一个α螺旋识别特异的顺式作用元件上的DNA序列，另一个α螺旋则结合在DNA上，调控基因的转录。螺旋-转折-螺旋结构图（2）锌指结构定义：是一种常出现在DNA结合蛋白中的结构基元。是由一个含有大约30个氨基酸的环和一个与环上的4个Cys或2个Cys和2个His配位的Zn构成，形成的结构像手指