第十一章核酸的生物合成

•第一节DNA的生物合成•第二节RNA的生物合成第十一章核酸的生物合成中心法则涉及的几个概念复制：是亲代双链DNA按碱基配对原则，准确形成两个相同核苷酸序列的子代DNA分子的过程。两条DNA链都可作为复制的模板。转录：是以一条DNA链为模板，将DNA链上储存的遗传信息按碱基配对原则准确转换成互补的mRNA的过程。翻译：是以mRNA为模板，将mRNA上的遗传信息转换成蛋白质的氨基酸序列的过程。中心法则：遗传信息由DNAmRNAPRO的流动途径。蛋白质翻译转录逆转录复制复制DNARNA中心法则：遗传信息由DNAmRNAPRO的流动途径。补充和完善之处：A：RNA作为遗传物质能自我复制，并作为mRNA指导PRO的合成。B：RNA能以逆转录的方式将遗传信息传递给DNA分子。第一节DNA的生物合成一、半保留复制1、半保留复制的概念DNA在复制时，两条链解开分别作为模板，在DNA聚合酶的催化下按碱基互补的原则合成两条与模板链互补的新链，以组成新的DNA分子。由于子代DNA分子中一条链来自亲代，另一条链是新合成的，这种复制方式称为半保留复制。2、DNA的半保留复制实验依据1958年Meselson&stahl用同位素示踪标记加密度梯度离心技术实验,证明了DNA是采取半保留的方式进行复制.[15N]DNA[14N-15N]DNA[14N]DNA[14N-15N]DNAMeselson-stahl实验（a）密度梯度离心的DNA带（b）对应于左侧DNA带的解释3、生物学意义保持了物种的相对稳定性.这和DNA的遗传功能相吻合，但这种稳定性是相对的，因为DNA在代谢上不是完全惰性物质：（1）一定条件下，DNA会损伤，需要修复；（2）在复制和转录中，DNA会有消耗，需要更新；（3）在发育和分化中，DNA特定序列可能修饰、删除、扩增、重排。4、遗传物质的条件：能储存自己的遗传信息；能准确将遗传信息传给后代；必须有能力在不损失亲代主要信息的前提下，做一些小的变化，即变异。二、与DNA复制有关的酶和蛋白质（原核生物）解旋酶DNA聚合酶III解链酶RNA引物引物酶和引发体DNA聚合酶ISSB3´3´5´3´5´5´RNA引物（一）DNA聚合酶1、DNA聚合酶ⅠpolⅠ(1)具5′3′聚合酶活性将脱氧核糖核苷三磷酸dNTP逐个添加到具有3′—OH末端的多核苷酸链上形成3，5—磷酸二酯键。特点：A：底物为dNTP；B：DNA模板(3′5′)；C：引物：RNA引物（带3′—羟基）；D：方向5′3′；F：产物DNA的性质与模板相同。DNA聚合酶催化的链延长反应5´RNA引物子链3´3´5´5´3´3´5´5´3´3´5´模板链(2)具有3′5′端核酸外切酶的活性有校对功能，能在3′—OH端将DNA链水解。以保证DNA复制的真实性。DNA聚合酶的3´-5´外切酶水解位点3´3´5´5´错配碱基3´-5´核酸外切酶水解位点(3)具有5′3′端核酸外切酶的活性由5′端水解DNA链，主要是切去一小段DNA，包括RNA引物和损伤DNA部分。polⅠ主要功能：用于修复DNA双螺旋区中的单链区，这些单链区是在DNA复制时或DNA受损伤后留下的。活性高。DNA聚合酶5´-3´外切酶活力5´-3´核酸外切酶水解位点单链缺口5´2、DNA聚合酶ⅡpolⅡ具有3′5′端核酸外切酶的活性,主要负责DNA的修复，在一定程度上参与DNA复制。活性低。功能不十分清楚，是一种修复酶。3、DNA聚合酶ⅢpolⅢ是使DNA链延长的主要聚合酶，目前已知全酶是由7种多肽形成的复合物，含有10种共22个亚基组分（α2ε2θ2ζ2г2δ2δ2′2χ2ψ2β2）和Zn原子。大肠杆菌DNA聚合酶Ⅲ全酶的结构和功能延长因子DNA聚合酶Ⅲ两个亚基夹住DNADNA聚合酶Ⅲ异二聚体核心酶校对引物的结合和识别促使核心酶二聚化（1）α亚基：具5′3′端聚合酶活性（需模板和引物）；（2）ε亚基具3′5′端核酸外切酶的活性。校对作用，以提高保真性；（3）α、ε、θ亚基相连形成核心酶polⅢ，θ亚基起组建作用；（4）核心酶+ζ亚基后成为二聚体，称为polⅢ′；（5）polⅢ′与γ、δ亚基结合，形成polⅢ′，γ、δ亚基可增强酶与模板的结合；（6）polⅢ′′与β亚基结合形成全酶，β亚基犹如夹子，夹住DNA向前滑动，不脱离，提高持续合成能力。大肠杆菌三种DNA聚合酶比较DNA聚合酶Ⅱ分子量每个细胞的分子统计数5´-3´聚合酶作用3´-5´核酸外切酶作用5´-3´核酸外切酶作用转化率DNA聚合酶Ⅰ109，000400+++1120，000100++-0.05400，00010-20++-50比较项目DNA聚合酶切除引物修复修复复制功能1999年发现聚合酶和，它们涉及DNA的错误倾向修复（erroounerepair）polⅠ不是DNA复制酶，理由：A、该酶合成DNA速度太慢，只是细胞内DNA复制速度的1%；B、持续合成能力较低，而细胞内DNA复制不会频繁中止；C、许多基因突变都会影响DNA复制，但都与polⅠ无关。4、DNA聚合酶ⅣⅤpolⅣpolⅤ1999年发现，涉及DNA的错误损伤修复。能在DNA许多损伤部位继续复制，而正常的polⅠ、polⅡ、polⅢ在此部位不能形成正确碱基配对而停止复制，在跨越损伤部位时造成错误倾向的复制。真核生物的DNA聚合酶：有六种α：在DNA复制中起主要作用，与随后链合成有关；δ：在DNA复制中起主要作用，与领头（前导）链合成有关，具有3′5′端核酸外切酶的活性；β：修复功能；γ：位于线粒体中，与线粒体DNA复制有关；ε：具3′5′端核酸外切酶的活性；附属蛋白：具3′5′端核酸外切酶的活性。（二）解螺旋酶（helicase）使DNA双螺旋的两条链分开。条件：ATP提供能量，有单链DNA存在。随后链：解旋酶结合于它的模板上，移动方向是5′3′；领头链：另一种解旋酶叫rep蛋白，移动方向是3′5′。（三）拓扑异构酶（DNA松弛酶）（topoisomerase）涉及超螺旋的松弛，复制后又涉及到它们的再次形成。正超螺旋（左）：双螺旋DNA处于拧紧状态时形成的超螺旋，使DNA解开双螺旋困难：负超螺旋（右）：双螺旋DNA处于拧松状态时形成的超螺旋。拓扑异构酶对DNA的超螺旋进行精确调节，从而在DNA重组修复和DNA其它转变中起作用。分为两类：1、拓扑异构酶Ⅰ：可瞬时打开双螺旋的一条链，然后再连接。不需能量，同转录相关。2、拓扑异构酶Ⅱ；使DNA双链同时断裂，然后再连接。需能量ATP，同复制相关。拓扑异构酶Ⅰ可除去负超螺旋，拓扑异构酶Ⅱ可引入负超螺旋，消除复制前产生的正超螺旋，协同作用控制DNA拓扑结构，有利于DNA解开双螺旋。（四）引发酶（引物合成酶）引物的合成由引发酶催化完成，这些酶在模板单链DNA上识别特殊序列，合成RNA引物。它本身没有活性，需要与“引发前体”结合在一起，形成“引发体”后才有活性。复制早期易发生碱基参入错误，用RNA较好，然后通过polⅠ的5′3′端核酸外切酶的活性切去，代之以dNMP，可消除最初阶段的错误。（五）其它蛋白因子1、单链结合蛋白（single-strandbindingprotein，SSB）结合在单链DNA分子上，功能是稳定已被解开的DNA单链，阻止复性和保护单链不被核酸酶降解。2、引发前体由六种蛋白质组成（DnaB、DnaC、Dnan、Dnan′、Dnan′′、Dnai），与RNA引物合成酶结合，组装成引发体（primosome）。功能：识别合成起始位点功能，可沿模板链方向移动，移动到一定位置即可引发RNA引物合成，从而合成领头链和冈崎片段。引发体成分（六）DNA连接酶催化子代双链DNA中的切口处的相邻3′—OH和5′—磷酰基之间形成磷酸二酯键。但不能将两条游离的DNA单链连接起来。同时该酶要求含有3′—OH和5′—磷酰基的DNA片段能以氢键与互补链结合。DNA—3′—OH＋P—5′—DNA＋ATP（NAD+）DNA—3′—O—P—5′—DNA＋AMP＋PPi（NMN）E,coli连接酶催化下的连接机制连接酶连接切口Mg2+连接酶ATP或NAD＋AMP+PPi或NMN+AMPATCGPTTPPPAACCTGAPACPPPPOHTGGATCGPTTPPPAACCTGAPACPPPTGGP缺口3'3'5'5'5'5'3'3'模板链模板链三、DNA的复制过程（原核生物）DNA的合成是以四种脱氧核苷三磷酸即dATP、dGTP、dCTP、dTTP为前体，在DNA聚合酶的催化下，向DNA的3′—OH端添加脱氧核苷酸，在DNA的3′—OH与添加的脱氧核苷酸的5′—磷酰基间形成3，5—磷酸二酯键，反应中脱去一个焦磷酸基团。合成方向：5′3′添加到链上的每个核苷三磷酸是按照模板链的顺序由碱基互补配对原则选择的。反应的通式可写为：（NMP）n—3′—OH＋dNTP（NMP）n＋1—3′—OH＋PPiDNA聚合酶催化的链延长反应5´RNA引物子链3´3´5´5´3´3´5´5´3´3´5´模板链（一）双链的解开（起始）1、复制原点(ori或o)DNA分子复制的特定位置，是一段指示复制起始的序列，多富含A、T的区段。E.coli的复制原点由245个碱基对组成，关键是成串排列的3个13bp序列（GATCTNTTNTTTT）和间隔排列的4个9bp序列（TTATCCACA，是DnaA蛋白结合位点）大肠杆菌复制起点成串排列的重复序列GATCTNTTNTTT成串排列的三个13bp序列共有序列共有序列TTATCCACADnaA蛋白结合位点四个9bp序列DnaADnaB(解螺旋酶)SSB大肠杆菌DNA复制起点在起始阶段的结构模型E.coli的oriC结构模式aOriC内富含A-T序列和4个9碱基对重复序列的分布b在oriC处复制起始模式原核生物：只有一个复制原点。第二次复制可在第一次复制完成之前开始复制。真核生物；可在DNA链上的多个不同位点同时起始复制。所以真核生物的DNA复制速度比原核生物快些。真核生物DNA的多起点复制2、复制叉（replicationforks）复制叉：复制中的DNA分子，未复制的部分是亲代双螺旋，而复制好的部分是分开的，由两个子代双螺旋组成，复制正在进行的部分叫做复制叉。DnaA蛋白是关键成分，大约20个与复制原点的4个9bp序列结合，使DNA连续不断变性，启动解链过程复制子：基因组能独立进行复制的单位。每个复制子含有控制复制起始的起点，可能还有中止复制的终点。果蝇胚胎中复制DNA的电子显微镜照片从图中可以看到大量的复制叉，左下角为照片的示意图方向：复制叉从起始点出发，沿DNA移动，移动方向与前导链的延长方向相同。复制可能是单向的，也可能是双向的，两个方向的复制速度不一定相同。大多数是双向的。眼状结构：线状DNA分子上的正在复制的部分形成；θ结构：环状DNA分子上的正在复制的部分形成。DNA的双向和单向复制环状DNA复制时所形成的Q结构起始点复制叉的推进复制叉起始点起始点起始点复制叉复制叉未复制DNA单向复制双向复制两种复制模式（a）单向复制模式（b）大肠杆菌染色体DNA双向复制模式单向复制i双向复制观察到的放射自显影图象18%质粒ColE1的单向复制示意图单向复制最早研究DNA复制起点和方向的是J.Cairns（1963年）。θ型DNAReplication（二）RNA引物的合成引发酶与引发前体结合形成引发体，引发体在复制叉上移动，识别合成的起始点，引发RNA引物的合成，该过程需ATP提供能量。方向：以DNA为模板，5′3′长度：几个至10个核苷酸，5′端含3个磷酸残基，3′端为游离羟基。为什么需要RNA引物、而且最后要切除？1、DNA聚合酶有校正功能，每引入一个核苷酸都要复查一次，无误后方继续下去，它不能从无到有合成新的链，因为在未核实前一个核苷酸处于正确配对状态时是不会进行聚合反应的；2、RNA引物是从新开始合成的，错配的可能性大，在完成引物功能后即将它删除，而代之以高保真的DNA链。（三）DNA链的延长在一个复制叉内两条链的复制方向、合成