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第十二章、现代生物技术现代生物技术，又称为生物工程。它是以现代生物学基础理论为指导发展起来的生物操作技术。它的主要研究领域有细胞工程基因工程蛋白质工程酶工程微生物工程（发酵工程）现代生物技术的核心第一节细胞工程细胞工程是指应用现代生物学的理论和方法，根据人们的需要和设计，在细胞水平上重组细胞的结构和内含物，以改变生物的结构和功能的生物工程技术。是一门在细胞水平上的生物工程技术。细胞工程是生物工程的核心技术，它包括：细胞培养技术、细胞融合技术、胚胎移植技术、细胞核移植技术和染色体工程。一、细胞培养技术细胞培养又称为组织培养。其方法：从动物或植物内取出器官、组织或经处理分散的细胞，置于一种模拟生物体内环境的人工培养基中培养，使其在离体的情况下，生存、生长、发育乃至繁殖。细胞培养包括单个细胞培养、组织培养和器官培养。植物的细胞具有发育的全能性。应用：单倍体育种。动物的细胞虽然具有遗传的全能性，但除卵细胞外，都不具有发育的全能性，只有卵细胞具有发育成完整个体的能力。应用：干细胞培养。动、植物的细胞和组织培养技术是细胞工程的基础技术，也是整个生物工程的重要技术。克隆培养：将高度稀释的游离细胞悬液加入培养瓶中，各个细胞贴壁后，彼此距离较远，生长增殖。群体培养：将含有一定数量细胞的悬液置于培养瓶中，让细胞贴壁生长，汇合后形成均匀的单细胞层；细胞培养组织培养1958美国斯蒂伍德用胡萝卜切片在培养液中培养成整株。细胞先分裂愈伤组织，后经适当激素诱导，分化出根茎叶。组织培养最早用于名贵花卉繁殖。荷兰现在是最大的花卉生产国。细胞培养技术在农业上的应用我国育种专家利用细胞培养技术中的单倍体育种技术已培育出多种玉米、小麦、水稻、烟草等农作物优良品种。细胞培养技术的优点：（1）不受土地限制（试管育苗）。（2）不受季节影响。（3）育苗速度快。（4）节省种子，降低播种成本。动物细胞培养是动物细胞工程的一项基本技术，是动物细胞融合、细胞核移植和基因工程的基础。二、细胞融合技术（细胞杂交技术）细胞融合技术，是通过人工诱导，把两种或两种以上遗传性不同的生物细胞融合在一起，从而获得兼备两个亲本遗传性状的杂交细胞的技术。方法：可用植物的各种组织为材料，经过果胶酶或纤维素酶等处理，使细胞膜溶解掉，成为没有细胞膜的“裸细胞”，再进行不同细胞的杂交，形成杂种细胞。例如：已经成功的有萝卜+甘蓝、粉蓝烟草+郎氏烟草、番茄+马铃薯等等。应用：1、细胞融合育种；2、研制单克隆抗体。细胞融合生物方法：某些病毒如：仙台病毒、副流感病毒和新城鸡瘟病毒的被膜中有融合蛋白（fusionprotein），可介导病毒同宿主细胞融合，也可介导细胞与细胞的融合，因此可以用紫外线灭活此类病毒诱导细胞融合。化学方法（聚乙二醇PEG）、物理方法（电激和激光）：使膜脂分子排列的改变，去掉作用因素之后，质膜恢复原有的有序结构，在恢复过程中便可诱导相接触的细胞发生融合。世界杂交水稻之父----袁隆平单克隆抗体技术正常淋巴细胞（如小鼠脾细胞）具有分泌抗体的能力，但不能在体外长期培养，瘤细胞（如骨髓瘤）可以在体外长期培养，但不分泌抗体。1975年英国科学家将两种细胞杂交而创立了单克隆抗体技术。杂合细胞三、胚胎移植技术是从动物体内取出卵细胞，在试管里进行授精，并培育成胚胎，然后再植入母体输卵管内，孕育产仔。例如：试管羊、试管兔等。试管婴儿使精子与卵子在体外相遇并受精，这就是试管婴儿。试管婴儿的医学术语称体外受精-胚胎移植。由于体外受精、胚胎发育所需外界条件较高，所以做一例“试管婴儿”的费用也较高。1978年，世界上第一例“试管婴儿”在英国奥德海姆总医院诞生。1988年我国第一例“试管婴儿”在北京出世。“试管婴儿”的出现为许多没有子女的夫妇带来了福音。四、细胞核移植技术（细胞亚结构移植）五、染色体工程细胞核移植技术也称为克隆技术，是将一个细胞的细胞核，移植到另一个去核的卵细胞中，形成具有新的遗传基因的生物个体的技术。每一种生物都有自己特殊的染色体组成，同一物种的染色体数目和组型是稳定的。如二倍体、单倍体、三倍体。染色体工程是指以染色体为操作单位，通过染色体的添加、换代、易位等方式有目的地改造生物的结构和功能的技术。染色体工程具有高效、安全和简便的优点，是目前进行动、植物品种改良的主要育种方法。多倍体的获得体细胞中仅含有一个染色体组，则称为“单倍体”。蜜蜂的雄蜂就是单倍体。对于植物，可以用花药培养法来获得单倍体植株。单倍体再经过秋水仙碱处理诱导染色体加倍，又成为二倍体。其后代不再发生孟德尔式的性状分离，可迅速稳定遗传性，成为一个新品种。二倍体经诱导染色体加倍，就成为“四倍体”。四倍体植物一般茎粗、叶大、花大、果实大，在生产实践中颇有利用价值。但四倍体植物的种子少，不适合利用种子的农作物（如禾谷类）。三倍体二倍体与四倍体杂交，可以得到“三倍体”。三倍体的减数分裂不正常，不能产生种子。无籽西瓜就是这样杂交得到的三倍体。香蕉是自然产生的三倍体。（1）第二节基因工程基因工程----又称为DNA重组技术，它是利用DNA重组技术进行生产或改造生物产品的技术。基因工程操作的单位是整个基因，因此，基因工程是在分子水平上进行改造和设计生物的结构和功能的生物工程技术。基因工程已经成为现代生物技术的核心技术。一、DNA重组的基本工具1、限制性内切酶——“分子剪刀”2、DNA连接酶——“分子针线”限制性内切酶的发现1960年，瑞士科学家阿尔伯在观察大肠杆菌时，发现了一种酶。这种酶，它能识别DNA顺序上特定的DNA位置并在这一位置进行切割。这种酶被称为限制性内切酶，后来被广泛地使用于基因工程中，阿尔伯因此荣获了1978年度诺贝尔奖。DNA连接酶1967年，世界上有5个实验室几乎同时而且独立地发现并提取出一种酶，这种酶可以将两个DNA片段连接起来，修复好DNA链的断裂口。它和内切酶是一对好搭档，一个切，一个接，共同在DNA分子重组中扮演重要角色。只要在用同一种“分子剪刀”剪切的两种DNA碎片中加上“分子针线”，就会把两种DNA片段重新连接起来。3、基因工程的基本原理：生物体的遗传信息承载于细胞核里的DNA上，利用限制性内切酶能够识别DNA上的碱基顺序并能断裂DNA的功能，有选择地获取DNA上带有遗传信息的基因片段，再通过连接酶把断裂下来的两个DNA片段连接起来，成为一条完整的、已经改变了遗传信息的新的DNA杂种分子。二、基因工程的操作程序1、获取所需要的基因（目标基因）；2、将目标基因与基因载体相结合；3、重组目标基因的导入；4、转基因细胞或个体的鉴别与筛选；5、对筛选出的转基因细胞或个体进行培养、检测。目标基因获取质粒是细菌染色体DNA以外的环状双链DNA分子目标基因导入产品表达获得目标基因的方法①从生物基因组中分离。一种办法是用“分子剪刀”即限制性内切酶剪切供体ＤＮＡ分子，把它切成一些比基因略长的片段，然后再从中找出包含所需目的基因的ＤＮＡ片段。②逆转录合成。通常以RNA为模板，在逆转酶下合成DNA，称其为ｃDNA。又称所谓的基因模板合成法，用这种方法人们已先后合成了家兔、鸭和人的珠蛋白基因、羽毛角蛋白基因等。③人工合成。如果某种蛋白质的基因是已知的。可以通过化学方法合成。基因导入方法1、直接导入法：（1）电击法：借助电击仪高压脉冲把目的基因打入宿主细胞。（2）显微注射法：利用微量注射器在显微镜下直接把目的基因注入宿主细胞。（3）直接吸收法：把目的基因和宿主细胞混在一起，让其吸收。（4）基因枪法：在金属微粒上涂一层目的基因，然后发射到宿主细胞中。2、间接导入法：又称感染，将目的基因放在载体上，感染到要表达的细胞中。常用的载体是质粒、λ噬菌体、科斯质粒。三、人类基因性疾病的研究与基因疗法：1、遗传病的基因疗法；2、癌症的基因疗法；3、心脏病的基因疗法；四、转基因动物研究及应用1、转基因鱼；2、转基因哺乳动物（1）动物乳腺生物反应器技术；（2）转基因动物食品正走向人类。3、转基因家禽；通过转基因技术，动物的乳腺可以成为我们人类的“制药厂”，以生产医用蛋白。目前人们的研究主要集中在猪、牛、羊、鼠、兔等动物身上。估计，人用蛋白药物的全球市场每年可达2000亿美元，而且还在持续增长。美国弗吉尼亚技术制药工程研究院培育转基因猪，其体内含有人类的基因，产乳后其乳汁含有人体蛋白。据估计，只需300～600只这样的母猪就能满足全世界对这种蛋白的需求。转基因动物五、转基因植物研究进展与应用1983年首例转基因作物在美国问世。1994年5月18日，美国联邦食品和药物管理局正式批准了第一种转基因作物——西红柿上市销售，由此开创转基因植物商业的先河。转基因技术显著的提高了农作物的品质和产量。到2000年，全世界转基因农作物的种植面积已经达到4420万公顷，其中，大豆占58%；玉米占23%；棉花占12%。在全球转基因农作物的总产量中，美国占68%。美国加州基因公司将西红柿中引起腐烂的基因加以复制之后，再重新以颠倒的方向注回西红柿，因而中止了西红柿内腐烂过程。这种技术可以运用在任何农作物上面，也可以将其中任何不佳的特质除掉。关于转基因食品的争论转基因作物从一出世就引起了激烈的争论。关于转基因食品利弊的争论还在持续，尚无结论。至少目前还没有充分的证据说明转基因作物及食品会导致危害人体、动物、植物及危害生态环境的后果，也没有一例消费者因食用转基因食品而导致健康损害的报告。国际消费者联合会向联合国食品委员会建议：转基因食品应有标识，让消费者明明白白地知道食品是否含有转基因，由他们自己决定是否选择这类食品。基因工程药物干扰素是两位美国科学家在1957年研究病毒的干扰现象时发现的一种抗病毒的特效药，能战胜病毒引起的感染，如水痘、肝炎和狂犬病等。用白细胞生产干扰素，每个细胞最多只能产生100～1000个干扰素分子；用基因工程技术改造的大肠杆菌发酵生产，在1～2天内，每个菌体能产生20万个干扰素分子。1977年，美国加利福尼大学的遗传学家H·W·博耶等人，用基因重组技术，在大肠杆菌中制造出5毫克的人生长激素抑制因子。如果用传统的办法从羊脑中提取5毫克生长激素抑制因子，那就要有50万个羊脑。第十三章21世纪生物技术的热点领域第一节克隆技术的研究现状与应用1997年，克隆羊“多莉”的诞生，引起了全世界的关注和关于克隆人问题的争议。一、克隆与克隆技术1、克隆的概念：克隆----是英文Clone的音译，即“无性繁殖”。是指从同一个生物个体经过无性繁殖而来的、具有与母体完全相同的遗传基因的后代以及由这些后代所组成的群体。克隆的本质特征：（1）无性繁殖；（2）与母体完全相同的遗传基因。2、关于克隆技术克隆有植物克隆和动物克隆，两者在技术上是有区别的。植物克隆是指从植物体细胞（枝条或小芽）直接再生出的新个体。如插扦、嫁接等。植物具有发育的全能性，因此其技术非常简单，不需要生殖细胞的参与。动物克隆是指不经过受精过程，而通过细胞核移植技术，将体细胞的细胞核移植到去核卵细胞中，再运用生物学方法，诱导卵子发育而形成的新个体。动物细胞不具有发育的全能性，因此，动物克隆需要卵细胞的参与，且技术难度大，操作程序复杂。二、多莉并不是与母体完全一样的克隆1997年，英国爱丁堡罗斯林研究所利用绵羊的体细胞，成功培育了首只哺乳动物——克隆绵羊“多莉”。两套独立的遗传系统：一套是细胞核内的DNA，是主要的遗传系统；一套是细胞质中线粒体中的DNA，完全来自于母亲。多莉的细胞核来自于芬兰母羊，细胞质来自于苏格兰黑面母羊，因此在生理上与其母体——芬兰母羊有明显的差别。2003年2月14日，“多利”由于无法治愈的肺部感染，被实施了安乐死，享年仅6岁半。（羊寿命12年）三、克隆技术的研究进展与应用1、克隆技术的早期发展状况60年代，英国科学家培育出“克隆青蛙”，揭开了克隆时代的序幕。70年代，我国生物学家童第周，将红鲤鱼的细胞核与鲫鱼的细胞质组合，培育出“鲤鲫活核鱼”。生长快、肉味美蛋白质含量高。90年代，人们将含有遗传信息的细胞核，移植到一个没有受精的去核卵细胞中，再把它放到一个母体中培育，产出“克隆”动物。实验胚