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-1-基因工程练习教师版(40分钟100分)1.(16分)质粒是基因工程中最常用的载体，质粒上有标记基因，如图所示，通过标记基因可推知外源基因插入的位置，插入位置不同，细菌在培养基上的生长情况也不同。如图表示外源基因的插入位置(插入点有a、b、c)。Ⅰ.(1)质粒的基本组成单位是。(2)将细菌放在含有四环素、氨苄青霉素的培养基中培养，属于基因工程操作中的步骤。Ⅱ.设计实验探究外源基因插入的位置。(3)步骤：①将导入外源基因的细菌进行培养产生大量细菌。②分组：将细菌平均分成两组并标号为1、2。③培养：将第1组细菌放入中培养，将第2组细菌放入中培养。④观察并记录结果。(4)预测实验结果及结论：①若1组、2组均能正常生长，则外源基因插入点是。②若1组能正常生长，2组不能生长，则外源基因插入点是。③若1组不能生长，2组能正常生长，则外源基因插入点是。【解析】(1)质粒是小型环状DNA分子，其基本组成单位是脱氧核苷酸。(2)抗四环素基因和抗氨苄青霉素基因都属于标记基因，其目的是便于目的基因的检测与鉴定。(3)分别将导入外源基因的细菌放在含氨苄青霉素的培养基和含四环素的培养基中进行培养，观察能否生长。(4)若目的基因插入a点，则受体细胞既具有抗四环素的能力，又具有抗氨苄青霉素的能力；若目的基因-2-插入b点，则受体细胞只具有抗四环素的能力；若目的基因插入c点，则受体细胞只具有抗氨苄青霉素的能力。以此可判断目的基因插入的位置。答案：(1)脱氧核苷酸(2)目的基因的检测与鉴定(3)③含氨苄青霉素的培养基含四环素的培养基(4)①a②c③b2.(20分)(2014·天津高考)嗜热土壤芽孢杆菌产生的β-葡萄糖苷酶(BglB)是一种耐热纤维素酶，为使其在工业生产中更好地应用，开展了以下试验：Ⅰ.利用大肠杆菌表达BglB酶(1)PCR扩增bglB基因时，选用基因组DNA作模板。(2)下图为质粒限制酶酶切图谱。bglB基因不含图中限制酶识别序列。为使PCR扩增的bglB基因重组进该质粒，扩增的bglB基因两端需分别引入和不同限制酶的识别序列。(3)大肠杆菌不能降解纤维素，但转入上述构建好的表达载体后则获得了降解纤维素的能力，这是因为。Ⅱ.温度对BglB酶活性的影响(4)据图1、2可知，80℃保温30分钟后，BglB酶会；为高效利用BglB酶降解纤维素，反应温度最好控制在(单选)。A.50℃B.60℃C.70℃D.80℃-3-Ⅲ.利用分子育种技术提高BglB酶的热稳定性在PCR扩增bglB基因的过程中，加入诱变剂可提高bglB基因的突变率。经过筛选，可获得能表达出热稳定性高的BglB酶的基因。(5)与用诱变剂直接处理嗜热土壤芽孢杆菌相比，上述育种技术获取热稳定性高的BglB酶基因的效率更高，其原因是在PCR过程中(多选)。A.仅针对bglB基因进行诱变B.bglB基因产生了定向突变C.bglB基因可快速累积突变D.bglB基因突变不会导致酶的氨基酸数目改变【解题指南】(1)图示信息：Ⅰ.质粒作为载体，应具备的结构有限制酶切割位点、启动子、终止子和标记基因等。Ⅱ.图1表示温度对酶活性的影响，图2表示不同温度下酶的热稳定性的大小。(2)关键知识：获取目的基因、基因表达载体的构建、酶的活性和热稳定性、诱变育种的原理。【解析】本题考查基因工程、酶的活性和变异的相关知识。(1)bglB基因存在于嗜热土壤芽孢杆菌基因组中，故应以该菌的基因组DNA为模板进行PCR扩增。(2)目的基因与质粒进行重组时，需将目的基因插入启动子和终止子之间，且应靠近启动子和终止子，结合示意图可知，应在扩增的bglB基因两端分别引入NdeⅠ和BamHⅠ两种限制酶的识别序列。(3)该基因表达载体中含有bglB基因，其可表达产生β-葡萄糖苷酶，可分解纤维素，这样大肠杆菌就获-4-得了分解纤维素的能力。(4)由图2可知，BglB酶在80℃保温30分钟后，就会失活；由图1可知，当温度为60～70℃时，酶活性较高，而由图2可知，70℃保温30分钟，酶活性会减弱，而60℃保温30分钟后酶活性基本不发生变化，由此可知为高效利用BglB酶降解纤维素，反应温度最好控制在60℃。(5)在bglB基因扩增过程中加入诱变剂进行诱变处理，相比于诱变剂直接处理嗜热土壤芽孢杆菌，针对性更强；基因突变是不定向的；由于PCR过程中基因扩增即DNA复制快速进行，发生突变后可进行快速累积，进而便于筛选；基因突变可能导致氨基酸数目的改变，如突变后的密码子变为终止密码子，可导致蛋白质合成提前终止，进而导致氨基酸数目变少。答案：(1)嗜热土壤芽孢杆菌(2)NdeⅠBamHⅠ(3)转基因的大肠杆菌分泌出有活性的BglB酶(4)失活B(5)A、C【易错提醒】限制酶的使用及作用特点的三点提醒(1)获取目的基因和切割载体时不能选用识别两种序列的限制酶，否则产生的碱基末端不相同。(2)当限制酶剪切目的基因一次时，获得的黏性末端或平末端有2个，而不是1个，若剪切目的基因两次，共产生4个黏性末端或平末端。(3)限制酶切割载体的切割位点并不是任意的，必须保证至少有1个标记基因的完整性，以便于检测。3.(12分)(2014·海南高考)下图是将某细菌的基因A导入大肠杆菌内，制备“工程菌”的示意图。据图回答：(1)获得A有两条途径：一是以A的mRNA为模板，在酶的催化下，合成互补的单链DNA，然后在的作用下合成双链DNA，从而获得所需基因；二是根据目标蛋白质的序列，推测出相应的mRNA序列，然后按照碱基互补配对原则，推测其DNA的序列，再通过化学方法合成所需基因。(2)利用PCR技术扩增DNA时，需要在反应体系中添加的有机物质有、、4种脱氧核糖核苷酸和耐热性的DNA聚合酶，扩增过程可以在PCR扩增仪中完成。(3)由A和载体B拼接形成的C通常称为。-5-(4)在基因工程中，常用Ca2+处理D，其目的是。【解题指南】(1)题干关键词：“将某细菌的基因A导入大肠杆菌内”。(2)关键知识：基因工程的原理和技术、蛋白质工程和PCR技术的应用。【解析】本题主要考查基因工程及PCR技术应用的相关知识。(1)利用逆(反)转录法合成目的基因的过程是：以mRNA为模板，在逆(反)转录酶的催化作用下合成单链DNA，然后在DNA聚合酶的作用下，合成双链DNA分子；根据蛋白质工程合成目的基因的过程是：根据目标蛋白质的氨基酸序列，推测相应的mRNA序列，然后按照碱基互补配对原则，推测DNA中脱氧核苷酸的排列顺序，通过化学方法合成。(2)PCR过程中需要酶、底物、模板、引物等条件。(3)目的基因和载体结合，形成基因表达载体。(4)在利用大肠杆菌做受体细胞时，需要先用Ca2+处理，使之成为感受态细胞，有利于其吸收重组DNA分子。答案：(1)逆转录DNA聚合酶氨基酸脱氧核苷酸(2)引物模板(A基因)(3)基因表达载体(4)使其成为感受态细胞，有利于吸收重组DNA分子4.(15分)(2015·吉林模拟)转基因草莓中有能表达乙肝病毒表面抗原的基因，由此可获得用来预防乙肝的一种新型疫苗，其培育过程如下图所示(①至④代表过程，A至C代表结构或细胞)：(1)在图中①基因表达载体的构建过程中，为了使目的基因正常表达，目的基因的首端必须有识别和结合的部位。若选择的限制酶切出的DNA片段是平末端，应选择进行连接。(2)将目的基因导入受体细胞的方法很多，在该题中涉及的方法是，之所以要把目的基因插入Ti质粒的T-DNA中，这是利用T-DNA的特点。(3)过程②的具体操作是：先用处理农杆菌，使其处于感受态；再将含乙肝病毒表面抗原基因的重组Ti质粒溶于缓冲液中与经处理的农杆菌混合，完成转化过程。-6-(4)图中③和④过程分别叫做，将叶盘培养成草莓幼苗所依据的原理是。(5)乙肝病毒表面抗原的基因能否在草莓植株体内维持稳定遗传的关键是，通常采用的方法进行检测。【解析】本题考查基因工程及转基因生物的安全性的相关知识，意在考查对基因工程的理解及运用所学知识解决实际问题和识图的能力。(1)基因表达载体由启动子、目的基因、终止子和标记基因等组成，其中启动子是RNA聚合酶识别和结合位点；根据酶的来源不同，DNA连接酶分为两类：E·coliDNA连接酶和T4DNA连接酶，这二者都能连接黏性末端，但是T4DNA连接酶还可以连接平末端。(2)将目的基因导入受体细胞的方法很多，在该题中涉及的方法是农杆菌转化法。农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上。(3)图中②过程是将重组质粒导入农杆菌，由于受体细胞是细菌，常用Ca2+处理使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，称为感受态细胞，以完成转化过程。(4)图中③过程是让叶盘细胞脱分化形成愈伤组织，进而再经④再分化形成幼苗，此过程叫做植物组织培养；原理是植物细胞的全能性。(5)乙肝病毒表面抗原的基因能否在草莓植株体内维持稳定遗传的关键是目的基因是否插入了受体细胞的染色体DNA上，通常采用DNA分子杂交的方法进行检测。在分子水平上，还可采用抗原-抗体杂交的方法来检测转基因草莓果实提取液中有无相应的抗原。答案：(1)RNA聚合酶T4DNA连接酶(2)农杆菌转化法可转移至受体细胞并整合到受体细胞的染色体DNA上(3)Ca2+(4)脱分化和再分化植物细胞的全能性(5)目的基因是否插入了受体细胞的染色体DNA上DNA分子杂交5.(12分)(2015·唐山模拟)生物分子间特异性结合的性质广泛用于生命科学研究。以下实例为体外处理“蛋白质-DNA复合体”获得DNA片段信息的过程图。据图回答：(1)过程①酶作用的部位是，此过程只发生在非结合区DNA，过程②酶作用的部位是。(2)①②两过程利用了酶的特性。(3)若将得到的DNA片段用于构建重组质粒，需要将过程③的测序结果与酶的识别序列进行比对，以确定选用何种酶。(4)如果复合体中的蛋白质为RNA聚合酶，则其识别、结合的DNA序列区为基因的。(5)以下研究利用了生物分子间特异性结合性质的有(多选)。-7-A.分离得到核糖体，用蛋白酶酶解后提取rRNAB.用无水乙醇处理菠菜叶片，提取叶绿体基粒膜上的光合色素C.通过分子杂交手段，用荧光物质标记的目的基因进行染色体基因定位D.将抑制成熟基因导入番茄，其mRNA与催化成熟酶基因的mRNA互补结合，终止后者翻译，延迟果实成熟【解析】(1)DNA酶作用于DNA分子后，若将DNA分子切割成片段，应作用于磷酸二酯键，蛋白酶作用于蛋白质中的肽键。(2)酶的作用特点是具有专一性。(3)若用DNA片段构建重组质粒，需要与限制性核酸内切酶切割的识别序列进行比对，选用切割后获得的相同片段所对应的限制性核酸内切酶进行切割。(4)RNA聚合酶特定结合启动子中RNA聚合酶结合位点。(5)蛋白酶特定处理蛋白质，DNA分子杂交和mRNA与基因的互补都体现了碱基互补配对原则。答案：(1)磷酸二酯键肽键(2)专一性(3)限制性核酸内切(4)启动子(或转录起始区)(5)A、C、D6.(15分)图1表示含有目的基因D的DNA片段长度(bp即碱基对)和部分碱基序列，图2表示一种质粒的结构和部分碱基序列。现有MspⅠ、BamHⅠ、MboⅠ、SmaⅠ4种限制性核酸内切酶，它们识别的碱基序列和酶切位点分别为C↓CGG、G↓GATCC、↓GATC、CCC↓GGG。请回答下列问题：(1)图1的一条脱氧核苷酸链中相邻两个碱基之间依次由连接。(2)若用限制酶SmaⅠ完全切割图1中DNA片段，产生的末端是末端，其产物长度为。(3)若图1中虚线方框内的碱基对被T-A碱基对替换，那么基因D就突变为基因d。从杂合子中分离出图1及其对应的DNA片段，用限制酶SmaⅠ完全切割，产物中共有种不同长度的DNA片段。(4)若将图2中质粒和目的基因D通过同种限制酶处理后进行连接，形成重组质粒，那么应选用的限制酶是。在导入重组质粒后，为了筛选出含重组质粒的大肠杆菌，一般需要用添加的培养基-8-进行培养。经检测，部分含有重组质粒的大肠杆菌菌株中目的基因D不能正确表达，其最可能的原因是。【解题指南】解答本题特别关注以下三点：(