第十二章微生物发酵技术

第十二章微生物发酵技术第一节微生物发酵概论第二节工业发酵的工艺流程第三节工业发酵的主要产品发酵工程是一门具有悠久历史，又融合了现代科学的技术，是现代生物技术的组成部分。本章主要介绍发酵工程的基本内容和基本原理，重点介绍了工业发酵的工艺流程,还介绍了典型产品的发酵生产工艺，如青霉素，谷氨酸和维生素C的生产。第一节微生物发酵概论1857年巴斯德提出著名发酵理论：“一切发酵过程都是微生物作用的结果。”1929年Flemming爵士发现了青霉素，增加一大类新产品-抗生素。20世纪40年代，以获取细菌的次生代谢产物-抗生素为主要特征的抗生素工业成为微生物发酵工业技术的支柱产业。20世纪50年代，氨基酸发酵工业又成为微生物技术产业的又一个成员，实现了对微生物的代谢进行人工调节，这又使微生物技术进了一步。20世纪60年代，微生物技术产业又增加了酶制剂工业这一成员。20世纪70年代，为了解决由于人迅速增长而带来的粮食短缺问题，进行了非碳水化合物代替碳水化合物的发酵，如利用石油化工原料进行发酵生产，培养单细胞蛋白，进行污水处理，能源开发等。80年代以来，随着重组DNA技术的发展，可以按人类社会的需要，定向培养出有用的菌株，这为微生物发酵技术引入了遗传工程的技术，使微生物技术进入了一个新的阶段。目前，人们把利用微生物在有氧或无氧状态下生命活动来制备微生物菌体或其它代谢产物的过程统称为发酵。一、微生物发酵的概念及发展史1.微生物菌体发酵是以获得具有某种用途的菌体为目的的发酵。用于面包制作的酵母发酵及用于人类或动物食品的微生物菌体蛋白发酵是比较传统的菌体发酵工业。新的菌体发酵可用来生产药用真菌，如香菇菌、依赖虫蛹而生存的冬虫夏草菌、与天麻共存的密环菌等药用菌。2.微生物酶发酵酶普遍存在于动物、植物和微生物中。因为微生物种类多、产酶的品种多、生产容易和成本低等特点，所以目前工业应用的酶大多来自微生物发酵。3.微生物代谢产物发酵微生物代谢产物很多。在菌体对数生长期所产生的产物，如氨基酸、核苷酸、蛋白质和糖类等是菌体生长繁殖所必需的，这些产物叫做初级代谢产物。在菌体生长静止期，某些菌体能合成一些具有特定功能的产物，如抗生素、生物碱、植物生长因子等。这些产物与菌体生长繁殖无明显关系，叫做次级代谢产物。二、微生物发酵的类型4.微生物的转化发酵微生物的转化是利用微生物细胞的一种或多种酶，把一种化合物转变成结构相关的更有经济价值的产物。可进行的转化反应包括：脱氢反应、氧化反应、脱水反应、缩合反应、氨化反应、脱氨反应等。5.生物工程细胞的发酵是指利用生物工程技术所获得的细胞，如DNA重组的“工程菌”，细胞融合所得的“杂交”细胞等进行培养的新型发酵。此类发酵的产物多种多样，如用基因工程菌生产胰岛素、干扰素等。优良的微生物菌种是发酵工业的基础和关键，微生物资源非常丰富，广泛分布于土壤、水和空气中，尤以土壤中为最多1.从微生物分类学的角度把所需菌种分为：细菌类如短杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、梭状芽孢杆菌等；酵母菌如啤酒酵母、酒精酵母、汉逊酵母和假丝酵母等；霉菌如黄曲霉、红曲霉、青霉菌和赤霉菌等；放线菌如各种抗生素，链、庆大等。2.作为工业微生物发酵使用的菌种，通常有以下特点：(1)具有稳定的遗传学特性。(2)微生物生长和产物的合成对于基质没有严格的要求。(3)生长条件易于满足。(4)具有较高的各种酶活力。（5）对于包含体，要求在细胞破碎是不易破碎，而在目的产物的分离提出时，则易破碎。三、微生物发酵工业所用菌种1.微生物发酵过程是一个典型的化工过程。2.微生物发酵过程是一个典型的代谢控制发酵。3.微生物发酵工业又是一个有别于化工过程的一个工业。微生物发酵主要有以下几个特征：（1）反应条件温和。通常由于微生物的生理特性，要求温度为30℃～40℃、pH值中性偏酸性如酵母、霉菌、放线菌的发酵和pH值中性偏碱性如细菌的发酵。（2）无菌发酵，整个反应过程要求无菌。培养基无菌、空气无菌、补料和取样要求无菌操作、某些工程菌，其尾气也要求进行无菌处理。（3）非连续性生产。微生物的生理特性决定了发酵过程的非连续性，大部分的工业发酵是以间歇操作为基础进行的，目前可以实现连续化生产的是啤酒的连续化生产。四、微生物发酵的基本特征第二节工业发酵的工艺流程生物发酵工艺多种多样，但基本上包括菌种的选育、菌种培养基的配制、扩大培养和接种、发酵过程下游处理即分离提纯等几个过程。找到合适的菌种是发酵工程的前提。人们最初是从自然界寻找所需要的菌种，如谷氨酸发酵时常用菌有谷氨酸棒状杆菌等。但这种方法得到的菌种，产量一般都比较低。20世纪40年代，微生物学家开始用紫外线、激光、化学诱变剂等处理菌种，使菌种产生突变，以筛选出符合要求的优良菌种。随着细胞工程、基因工程等技术的日益成熟，科学家开始构建工程细胞或工程菌，用它们进行发酵，甚至能生产出一般微生物所不能生产的产品。一、菌种的选育在大规模的发酵生产中，需要将选育出的优良菌种经过多次扩大培养，让它们达到一定数量以后，再进行接种。二、菌种培养基的配制培养基是选择出的菌种生活的环境，对菌种有多方面的影响，所以至关重要。一般来说，培养基的配方要经过反复的实验才能确定。另外，发酵工程中所用的菌种多要求是纯培养的，即整个发酵过程不能混有杂菌，否则将导致产量大大下降，甚至得不到产品。例如，如果青霉素生产过程中污染了杂菌，这些杂菌会分泌青霉素酶，将形成的青霉素分解掉。因此，培养基和发酵设备都必须经过严格的灭菌。三、扩大培养和接种发酵过程一般是在发酵罐内进行的，发酵罐是一种圆柱形的容器，容量从几升到几百万升，罐上除有通气、搅拌、接种、加料、冷却等装置外，还有对温度、pH、通气量与转速等发酵条件进行检测和控制的装置。发酵过程中环境条件的变化，不仅会影响菌种的生长繁殖，而且会影响菌种代谢产物的形成。为了使发酵过程能顺利进行，要随时取样，检测培养液中的细菌数目、产物浓度，同时还要及时为发酵菌提供必需的营养，并严格控制温度、pH、溶氧、通气量与转速等发酵条件。四、发酵过程发酵结束后，要对发酵液或生物细胞进行分离和提取精制，将发酵产物制成合乎要求的产品。对发酵产品的要求不同，分离提纯的方法也相应有些区别。利用发酵工程生产的产品有菌种代谢产物和菌种本身（如酵母菌和细菌）两大类，如果产品是菌种，分离方法一般是通过过滤、沉淀从培养液中分离出；如果产品是代谢产物，则采用蒸馏、萃取、离子交换等方法提取。分离提纯后的产品，还要经过质量检查合格后，才能成为正式产品。五、分离提纯工艺流程第三节工业发酵的主要产品一、抗生素发酵生产抗生素是生物体在生命活动中产生的一种次级代谢产物。这类有机物质能在低浓度下抑制或杀灭活细胞，这种作用又有很强的选择性。抗生素主要用微生物发酵法生产，少数抗生素也可用化学方法合成，人们还对天然得到的抗牛素进行生化或化学改造，使其具有更优越的性能，这样得到的抗生素叫半合成抗生素，其数目已达到两万多种。抗生素不仅广泛用于临床医疗，而且已经用于农业、畜牧及环保等领域。青霉素是最早发现并用于临床的—种抗生素，1928年为英国人A.Fleming发现，40年代投入工业生产。在二战期间立刻大显身手，它能有效控制伤口的细菌感染，挽救了数百万战争中受伤者的性命。我们就以青霉素为例简单介绍抗生素的发酵生产过程。(一)青霉素发酵生产菌株最初由弗莱明分离的点青霉，只能产生2U／ml的青霉素。目前全世界用于生产青霉素的高产菌株，大都由菌株WisQl76(一种产黄青霉)经不同改良途径得到。70年代前育种采用诱变和随机筛选方法，后来由于原生质体融合技术、基因克隆技术等现代育种技术的应用，青霉素工业发酵生产水平已达85000U／ml以上。青霉素生产菌株一般在真空冷冻干燥状态下保存其分生孢子，也可以用甘油或乳糖溶剂作悬浮剂，在－70度冰箱或液氮中保存孢子悬浮液和营养菌丝体。(二)青霉素发酵生产培养基1、碳源目前普遍采用淀粉经酶水解的葡萄糖糖化液进行流加。2、氮源可选用玉米浆、花生饼粉、精制棉籽饼粉或麸质粉，并补加无机氮源。3、前体苯乙酸或苯乙酰胺，由于它们对青霉菌有一定毒性，故一次加入量不能大于0．1％，并采用多次加入方式。4、无机盐包括硫、磷、钙、镁、钾等盐类，铁离子对青霉菌有毒害作用，应严格控制发酵波中铁含量在30ug／ml以下。(三)青霉素发酵工艺1.种子制备种子制备阶段以生产丰富的孢子（斜面和大米孢子培养）或大量健壮的菌丝体（种子罐）为目的。2.发酵培养影响青霉素发酵产率的因素有环境因素，如pH值、温度、溶氧饱合度、碳氮组份含量等；有生理变量因素，包括菌丝浓度、菌丝生长速度、菌丝形态等，对它们都要进行严格控制。3.发酵后处理(1)过滤：采用鼓式真空过滤器，过滤前加去乳化剂并降温(2)提炼用溶媒萃取法。将发酵滤液酸化至pH2，加1/3体积的醋酸丁酯，混合后以碟片式离心机分离，得一次BA提取液。然后以1.3%～1.9%NaHCO3在pH6.8～7.1条件下将青霉素从BA中提取到缓冲液中。再调pH至2.0，将青霉素从缓冲液再次转入到BA中，方法同上，二次BA提取液。(3)脱色在二次BA提取液中加活性炭150一300g／10亿单位，脱色、过滤。(4)结晶用丁醇共沸结晶法。将二次BA萃取以0.5mol/LNaOH液萃取，调pH至6.4～6.8，得青霉素钠盐水浓缩液。加3～4倍体积的丁醇，在16～26℃，5～10mmHg下真空蒸馏，将水与丁醇共沸物蒸出，并随时补加丁醇。当浓缩到原来水浓缩体积，蒸出馏分中含水达2％～4％时，即停止蒸馏。青霉素钠盐结晶析出，过滤，将晶体洗涤后进行干燥得成品。可在60℃，20mmHg真空中烘16h，然后磨粉、装桶。氨基酸是构成蛋白质的基本单位，是人体及动物的重要营养物质。谷氨酸是一种重要的氨基酸。我们就以谷氨酸的发酵生产为例简单介绍一下氨基酸的发酵生产。(一)谷氨酸发酵生产的菌种谷氨酸酵生产菌种主要有棒状杆菌属、短杆菌属、小杆菌属及节杆菌属的细菌。除节杆菌外，其他三属中有许多菌种适用于糖质原料的谷氨酸发酵。这些细菌都是需氧微生物，都需要以生物素为生长因子。我国谷氨酸发酵生产所用菌种有北京棒状杆菌AS1299、钝齿棒状杆菌AS1542、HU7251及7338、B9等。这些菌株的斜面培养一般采用由蛋白胨、牛肉膏、氯化钠等组成，pH为7.0～7.2的琼脂培养基，32℃培养24h，冰箱保存备用。二、氨基酸发酵生产(二)谷氨酸发酵生产的原料制备谷氨酸发酵生产以淀粉水解糖为原料。淀粉水解糖的制备一般有酸水解法和酶水解法两种。国内常用的是淀粉酸水解工艺。(三)菌种扩大培养（1）一级种子培养采用液体培养基，由葡萄糖、玉米浆、尿素、磷酸氢二钾、硫酸镁、硫酸铁及硫酸锰等组成，pH为6.5～6.8；三角瓶内32℃振荡培养12h，贮于4℃冰箱备用。（2）二级种子培养培养基除用水解糖代替葡萄糖外，其他与一级种子培养基相仿。种子罐内32℃通气搅拌培养7～10h，即可移种或冷却至10℃备用。(四)谷氨酸发酵生产发酵初期，菌体生长迟滞，约2～4h后即进入对数生长期，代谢旺盛，糖耗快，这时必须流加尿素以供给氮源并调节培养液的pH值至7.5～8.0，同时保持温度为30～32℃。本阶段主要是菌体生长，几乎不产酸，菌体内生物素含量由丰富转为贫乏，时间约12h。随后转入谷氨酸合成阶段，此时菌体浓度基本不变，糖与尿素分解后产生的α-酮戊二酸和氨主要用来合成谷氨酸。这一阶段应及时流加尿素以提供氨及维持谷氨酸合成最适pH7.2～7.4，需大量通气，并将温度提高到谷氨酸合成最适温度34～37℃。发酵后期，菌体衰老，糖耗慢，残糖低，需减少流加尿素量。当营养物质耗尽，谷氨酸浓度不再增加时，及时放罐，发酵周期约为30h。(五)谷氨酸提取谷氨酸提取有等电点法、离子交换法、金属盐沉淀法、盐酸盐法和电渗析法，以及将上述方法结合使用的方法。国内多采用的是等电点法。三、维生素发酵生产维生素C又称抗坏血酸（ascorbicacid），能参与人体内多种代谢过程，使组织产生胶原质，影响毛细血管