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84第八章配子与胚胎生物技术第一节胚胎移植技术一、概述（一）概念（记忆，P253）胚胎移植（embryotransfer，ET）：又称借腹怀胎，受精卵移植。它是将体内（优秀母畜）、外生产的哺乳动物早期胚胎（一般情况下所移植的不是受精卵，而是发育至多细胞、桑椹胚或胚泡阶段的胚胎），（如果是体外内胚胎用手术或非手术的方法取出，在显微镜性下检出后），移植到同种的生理状态相同的雌性动物生殖道内，使之继续发育为正常个体的生物技术。提供胚胎的个体——供体（donor）接受胚胎的个体——受体（recipient）超数排卵和胚胎移植通常同时应用，合称超数排卵和胚胎移植（multipleovulationandembryotransfer，MOET），简称MOET技术（记忆，P209）（二）发展历史（熟悉，P209-211）1、试验研究阶段2、实际应用阶段3、产业化阶段（三）胚胎移植在畜牧业生产上的意义（P256，记忆）1、提高良种母畜繁殖力；2、简化良种引进方法；3、降低种质资源保护利用；4、加速育种进程；5、利于防疫；在养猪业中，为了培育无特异性病原体(SPF)猪群，向封闭群引进新的个体时，作为控制疾病的一种措施，采用ET技术剖腹取仔的方法。6、促进生殖生理理论与胚胎生物技术的发展二、ET的生理学基础与基本原则（一）生理学原理（书P212，记忆）1、母畜发情后生殖器官的孕向发育母畜发情后数日甚至10余日内，生殖系统的变化相同，即在相同的时期，生理状态一致，子宫内的环境相同。2、早期胚胎的游离状态游离状态是胚胎采集、保存、培养和体外操作等重要理论基础。3、子宫对早期胚胎的免疫耐受性即胚胎移植不存在免疫问题。4、胚胎遗传物质的稳定性85胚胎的遗传特性不受受体母畜的影响。（二）ET遵循的基本原则（P212-213，记忆）1、胚胎移植前后所处环境的同一性（1）供体和受体在分类学上的属于同一物种；（2）胚胎发育阶段与受体发情时间上的一致性；（3）胚胎发育阶段与受体生殖道解剖位置的一致性。2、胚胎发育的阶段。ET时间应在妊娠时别发生之前，通常在供体发情配种后3~8d内收集胚胎，受体也在相同时间接受ET。3、胚胎的质量。保证质量。4、经济效益或科学价值。供胚应具独特经济价值，而受体要求生产性能一般，但繁殖性能良好，环境适应能力强。（三）ET应具备的条件（熟悉，P213）1、实验室条件2、技术条件3、胚胎来源二、胚胎移植的技术（记忆）（一）供、受体母畜的选择（P214）1、供体母畜健康，较高育种价值，生殖机能正常，已证明对超排反应较好。2、受体母畜健康、繁殖性能良好，体型较大。（二）受体母畜的同期发情（P214）同第四章第七节（三）供体母畜的超排（P214-216）1、超排方法（前已说）2、提高超排效果的措施（选择对象、规范化管理、优质药品）（四）供体母畜的配种（P216）适当的时间，优质精液对供体母畜进行输精。使用密度大、活率高的精液输精，输精次数2-3次，间隔8-10h。（五）胚胎采集（冲卵）（P216-219）定义：是利用特定的溶液和装置将早期胚胎从母畜子宫或输卵管中冲出并回收利用的过程。861、冲胚液的配制与灭菌：含5%犊牛血清的杜氏磷酸盐缓冲液（D-PBSS）。2、冲胚器械用途和准备（1）二路式或三路式冲胚管；（2）外科手术器械。（3）保定架（4）必备药品3、供体母畜的检查与处理供体牛在发情的第5-6d通过直检卵巢上黄体数，确定进行冲胚处理的牛的头数。两侧上有2个或2个以上的黄体才冲胚，冲胚时间在发情第7d进行。4、胚胎的收集（时间、方法）胚胎收集时间（记忆）：配种后3－8d后，发育至4-8细胞胚以上为宜（大多数动物）或桑葚胚或早期囊胚（配种后6-8d）（牛和水牛）收集胚胎的方法（记忆）（1）手术法（小动物和实验动物）在腹中线处作一切口，然后将子宫角和卵巢一起拉出，检查排卵点或血红体数量。冲胚方式采取：输卵管采胚法（于羊和兔）；子宫角采胚法（于羊、猪和兔等）（2）非手术法收集胚胎（大家畜）麻醉、消毒→直肠把握→充气→灌流冲胚液→消毒生殖道用含抗生素的生理盐水冲洗→2d后消黄（六）胚胎的检查胚胎的检查：是指在体视镜下从冲卵液回收胚胎，同时间差胚胎数量和质量。对发育正常的胚胎供移植或体外培养和保存。胚胎的鉴定：指应用各种手段对胚胎质量和活力进行评定或等级分类。形态学上可分为A、B、C、D或1、2、3、4。还有体外培养法、荧光法、测定大写活性和胚胎的细胞计数。（七）胚胎的保存（P221-224）胚胎保存：指将胚胎在体内、体外正常发育温度下，暂时储存起来而不使其失去活力；或将其保存于低温或超低温情况下，使细胞代谢处于新陈代谢和分裂速度减慢或停止，即使其发育处于暂时停顿状态，一旦恢复正常温度时，又能再继续发育。胚胎冷冻保存意义：适应ET产业化；便于运输、建立基因库。方法：异体活体保存（1-3d）常温保存，15-25℃（24h）低温保存0-5℃,目前认为5-10℃比较好，保存温度较短。超低温冷冻保存：常规冷冻保存（程序冷冻控制仪）和玻璃化冷冻保存（高浓度抗冻剂）（八）胚胎的移植（P224-225）1、手术法移植（小动物和实验动物）87与冲胚同。2、腹腔内窥镜法移植（人）3、非手术法移植：直肠检查黄体位置，然后似人工授精般将胚胎用移植管通过子宫颈放入到与黄体同侧的子宫角内，或两侧子宫角各放一枚胚胎。（1）直肠把握（2）移植到与黄体同侧的子宫角（九）受体移植后的饲养管理（P225）1、加强饲养管理2、妊娠诊断以便分群饲养和管理3、及时注射疫苗四、胚胎移植的实际效果和影响妊娠率的因素（P225-226）（一）胚胎移植的实际效果主要取决于：1、胚胎来源（1）排卵率：超排处理后有超排反应得供体所占百分率。（2）回收率：收集的卵子和胚胎占总黄体数的百分率。在50-80%，非手术法低于手术法（3）受精率：发育正常的胚胎数占所收集的卵子和胚胎总数的百分率。排出的恶卵子有形态不正常或未受精，有的胚胎发育迟缓或死亡的。以上三种情况决定了最后可利用的胚胎数。2、胚胎冷冻和胚胎分割的应用胚胎冷冻成功，使得胚胎的利用不受时间空间的限制，但冻胚的移植妊娠率下降5-20%。而利用胚胎分割则可以成倍增加胚胎的数量，降低成本，提高经济效益。（二）影响妊娠率的因素因为胚胎附植、妊娠的确立涉及胚胎、子宫环境和黄体之间的一系列协调关系，所以影响因素很多，主要因素如下：（1）胚胎因素（2）母体因素（3）其他因素胚胎移植效果（了解）新鲜一级和优级胚及自然发情受体受胎率50-60%新鲜一级和优级胚及同期发情受体受胎率40-50%体内一级和优级冻胚及自然发情受体受胎率35-45%体内一级和优级冻胚及同期发情受体受胎率30-40%体外一级和优级冻胚及自然发情受体受胎率25-30%体外一级和优级冻胚及同期发情受体受胎率20-30%88五、ET主要存在的问题（熟悉，P226-227）1、胚胎来源限制了NT的效率和实际应用；2、缺乏熟练操作的技术人员；3、胚胎冷冻保存仍存在很多问题；4、ET费用高，人力和时间耗费大，条件严格制约了其推广应用；5、羊、猪胚胎采集和移植主要采用手术法易造成粘连，受体重复使用受限制。六、ET技术的发展前景（了解，P227）1、牛羊的胚胎冷冻保存和移植技术已基本成熟，一些国家已进入产业化阶段，近年来，我国畜牧业发达地区推广速度很快，有潜在的开发前景；2、胚胎冷冻保存是实现ET产业化的重要保障，其具有重要意义。胚胎冷冻保存可以使：（1）使胚胎不受时间和空间的限制；（2）利于国内国际之间的品种交流；（3）能够解决印中和防止或减少疾病的传播；（4）加速品种改良和扩大优良品种覆盖率；（5）建立家畜和濒危动物的“基因库”，免受各种灾害造成品种灭绝的危险。（6）对于胚胎组织学、发育生物学、遗传育种学和胚胎生物技术的基础理论研究具有重要价值，为将来组织和器官的冷冻保存提高充分的理论依据。3、如何超排效果、简化技术操作过程，提高移植妊娠率等很多方面仍有很多工作要做。第二节体外受精一、IVF技术的发展历史（一）补充IVF概念（记忆）在自然条件下，哺乳动物精子和卵子的受精过程是在体内完成的。如将精子和卵子分别从公、母畜体内取出并经过一系列的处理，使精卵在体外条件下结合的过程，称为体外受精(invitrofertilization，IVF)。由于卵子和精子的受精过程是在实验室中完成，故通过这一技术而产下的动物又称为“试管动物”，如“试管牛”、“试管猪”、“试管婴儿”等。（二）发展历史（P228）1951年，美籍华人张明觉和澳大利亚Austin发现精子capacitation；20世纪60-80年代中期，纷纷得到了世界首例试管小鼠（1968）、大鼠（1974）、婴儿（1978），犊牛（1982）、绵羊和山羊（1985）、猪（1986）。我国学者卢克焕在爱尔兰建立了一整套牛体外受精技术体系，并利用该技术体系于1987年生产了世界上数量最多的试管牛群，并于1988年初又研究成功了世界首例完全体外的试管双犊。蒋和生等于1993年利用体外成熟的卵母细胞进行IVF，获得了我国首例试管水牛。20世纪80年代中期以后，IVF-ET技术在医学上得到广泛应用，成为治疗不孕症的主要方法之一；同时，家畜IVF技术（牛）发展迅速。采用能够IVF-ET技术，每对废弃的牛卵巢89可获得3头犊牛；80年代后期，牛0PU（ovumpickup）技术发展迅速，OPU和IVF-ET结合已成为扩大良种母牛群选择的重要的繁殖技术；至今，IVF不仅用于畜牧生产，同时也成为其他胚胎生物技术，如克隆、转基因、胚胎干细胞和性别控制等重要的辅助手段。二、IVF技术的基本操作程序（熟悉，P228-230）体外受精的主要内容包括：卵子的体外成熟（invitromaturation,IVM）卵子和精子的体外受精（invitrofertilization,IVF）受精卵的体外培养（invitroculture,IVC）（一）卵母细胞的采集和成熟培养（P228-230）1、卵母细胞的采集（1）超数排卵（实验动物或小型多胎家畜）（2）离体卵巢采卵（主要来源）方法：卵泡抽吸法和卵巢解剖法（3）活体采卵（优良品种）借助超声波探测仪或腹腔镜2、卵母细胞的选择（P229）卵丘细胞-卵母细胞复合体（cumulusoocytecomplex,COC）A：3层以上卵丘细胞紧密包围，细胞质均匀B：卵丘细胞低于3层，细胞质均匀C：无卵丘细胞包围（裸卵，光卵）D：死亡或退化的卵母细胞3、卵母细胞的体外成熟（IVC）（1）培养液：用于卵母细胞体外成熟的最为广泛基础培养液是M199。加入一定的血清和激素。（2）温度和气相：温度一般为38～39℃。气相一般要求在含5％C02的空气和最大湿度的环境。（3）培养时间：牛和羊卵母细胞体外成熟培养的时间一般为22～24h，而马为30～36h，猪为40～44h。（4）培养方法：通常采用微滴法（50～200ul）。（二）体外受精（IVF）1、精子获能处理：（1）培养：一定介质中培养（2）化学诱导：如肝素、钙离子载体法2、受精：即获能精子与成熟卵子的共培养，一般在获能液中完成受精过程。（三）胚胎培养（IVC）1、培养体系：90复杂胚胎培养液：如TCM199采取和体细胞共培养成分明确培养液：CZB、SOF、CRaa等2、培养方法：微滴法（3-10ul）3、受精后，卵母细胞应立即CO2培养箱中培养24～44h，其中牛22～24h，将假定的受精卵从受精液中取出，再在早期胚胎体外培养液中继续培养18～33h。受精后40～44h检查受精卵的分裂率。其中48-72h更换一次培养液（换1/2）。三、家畜IVF技术的发展现状和存在的问题（231-232）（一）发展现状（P231）牛：卵裂率（CR）80-90%，囊胚（BL）发育率%：40-50%，BL冷冻后能继续发育率80%，ET后产犊率30-40%。平均每个卵巢获A级卵母细胞10个，经IVF可获得3-4BL，ET后产犊1-2头。羊：CR：80-90%；BL：30-40%;BL冷冻