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1第42讲微生物的培养及应用[考纲要求]1.微生物的分离和培养。2.培养基对微生物的选择作用。考点一微生物的分离与培养1．培养基(1)概念：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。(2)营养组成：一般都含有水、碳源、氮源和无机盐。此外，还需要满足微生物生长对pH、氧气以及特殊营养物质的要求。(3)种类：按照物理性质可分为液体培养基和固体培养基。2．无菌技术(1)含义：指在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。(2)关键：防止外来杂菌的入侵。(3)不同对象的无菌操作方法(连线)3．大肠杆菌的纯化培养(1)制备牛肉膏蛋白胨固体培养基①操作步骤计算→称量→溶化→灭菌→倒平板②倒平板的方法及注意事项a．请用文字和箭头写出正确的倒平板操作流程：丙→乙→甲→丁。b．甲、乙、丙中的灭菌方法是灼烧灭菌。2c．丁中的操作需要等待平板冷却凝固才能进行。(2)纯化大肠杆菌的方法①纯化培养原理：想方设法在培养基上得到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的菌落，即可获得较纯的菌种。②纯化大肠杆菌的关键步骤：接种。③常用的微生物接种方法有两种a．平板划线法：是通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。b．稀释涂布平板法：是将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。系列稀释操作(如下图所示)：涂布平板操作(如下图所示)：(3)菌种的保存方法①对于频繁使用的菌种，可以采用临时保藏的方法。②对于需要长期保存的菌种，可以采用甘油管藏的方法。[思维诊断](1)培养基分装到培养皿后进行灭菌(2013·江苏，18A)(×)(2)从有机废水中分离分解有机物的微生物时，接种后的培养皿须放在光照培养箱中培养(2013·江苏，18C)(×)(3)消毒的原则是既杀死材料表面的微生物，又减少消毒剂对细胞的伤害(2013·重庆，5A)(√)(4)培养基一般都含有水、碳源、氮源和无机盐，有时还需要加入一些特殊的物质(√)(5)无菌操作的对象只要是没有生物活性的材料(如培养基、接种环等)都可采用高压蒸汽灭菌法进行灭菌(×)3(6)下图中甲为平板划线法中最重要的环节，乙为操作的结果：①每一次划线后要将接种环灼烧(√)②除第一次划线外，每一次划线的起点都是第一次划线的末端(×)(7)用稀释涂布平板法纯化大肠杆菌时，只要稀释度足够高，就能在培养基表面形成单个菌落(√)题组一培养基及其制备方法分析1．不同的微生物对营养物质的需要各不相同。下列有关一种以CO2为唯一碳源的自养微生物营养的描述，不正确的是()A．氮源物质为该微生物提供必要的氮素B．碳源物质也是该微生物的能源物质C．无机盐是该微生物不可缺少的营养物质D．水是该微生物的营养要素之一答案B解析碳源分为有机碳源和无机碳源。当有机物作为碳源时，既是碳源，又可作为能源；当无机物作为碳源时，只能作为碳源，不能作为能源。该碳源是二氧化碳，属于无机物，不能作为微生物的能源物质。2．下列关于制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的叙述中，错误的是()A．操作顺序为计算→称量→溶化→倒平板→灭菌B．将称好的牛肉膏连同称量纸一同放入烧杯C．待培养基冷却至50℃左右时倒平板D．待平板冷却凝固后将平板倒过来放置答案A解析制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的步骤是计算→称量→溶化→灭菌→倒平板，其顺序不能颠倒。牛肉膏容易吸潮，所以称好后需将称量纸一同放入烧杯，当牛肉膏溶化并与称量纸分离后，用玻璃棒取出称量纸。待培养基冷却到50℃左右，用手触摸锥形瓶刚刚不烫手，并且培养基处于溶化状态时开始倒平板，平板冷却凝固后才能倒置。1．培养基的配制原则(1)目的要明确：配制时应根据微生物的种类、培养目的等确定配制的培养基种类。4(2)营养要协调：注意各种营养物质的浓度和比例。(3)pH要适宜：细菌为6.5～7.5，放线菌为7.5～8.5，真菌为5.0～6.0，培养不同微生物所需pH不同。2．微生物对主要营养物质的需求特点不同种类的微生物代谢特点不同，因此对培养基中营养物质的需求也不同。(1)自养型微生物所需的主要营养物质是无机盐，碳源可来自大气中的CO2，氮源可由含氮无机盐提供。(2)异养型微生物所需的营养物质主要是有机物，即碳源必须由含碳有机物提供，氮源也主要是由有机物提供，部分异养型微生物也可以利用无机氮源。题组二无菌技术的操作3．微生物培养过程中，要十分重视无菌操作，现代生物学实验中的许多方面也要进行无菌操作，防止杂菌污染，请分析下列操作中错误的是()①煮沸消毒可以杀死微生物的营养细胞和部分芽孢②接种操作要在酒精灯火焰附近进行③无菌繁殖脱毒苗时，植物的外植体要进行消毒④家庭制作葡萄酒时要将容器和葡萄进行灭菌⑤培养基要进行高压蒸汽灭菌⑥加入培养基中的指示剂和染料不需要灭菌A．①③B．②④C．③⑤D．④⑥答案D解析无菌操作包括消毒和灭菌。需进行消毒处理的有植物的外植体及操作人员的双手等，需进行灭菌的有器皿、培养基、添加剂(指示剂或染色剂)等。煮沸可以杀死微生物的营养细胞和一部分芽孢，属于消毒；为防止空气中杂菌污染，接种时要在酒精灯火焰附近进行；家庭制作葡萄酒时所利用的微生物是葡萄表面的酵母菌，故不能灭菌；培养基常进行高压蒸汽灭菌。故④⑥操作错误。4．细菌培养过程中分别采用了高压蒸汽、酒精、火焰灼烧等几种不同的处理，这些方法依次用于杀灭哪些部位的杂菌()A．接种环、手、培养基B．高压锅、手、接种环C．培养基、手、接种环D．接种环、手、高压锅答案C解析一般说来灭菌是指彻底杀灭微生物使其永远丧失生长繁殖的能力，对于培养基、操作器皿和接种环等都需要灭菌。消毒仅指杀死物体表面或内部一部分对人体有害的病原菌而对被消毒的物体基本无害，如操作者的手和衣着需要消毒处理。高压蒸汽通常用于培养基的灭菌。用酒精擦拭双手是消毒的一种方法。火焰灼烧，可以迅速彻底地灭菌，适用于微生物的接种工具，如接种环。消毒和灭菌的辨析5项目条件结果常用方法应用范围消毒较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部的部分对人体有害的微生物煮沸消毒法日常用品巴氏消毒法不耐高温的液体化学药剂消毒法用酒精擦拭双手，用氯气消毒水源灭菌强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子灼烧灭菌法接种工具干热灭菌法玻璃器皿、金属工具高压蒸汽灭菌法培养基及容器的灭菌题组三大肠杆菌的纯化方法及过程分析5．下图中甲是稀释涂布平板法中的部分操作，乙是平板划线法的操作结果。下列叙述中错误的是()A．甲中涂布前要将涂布器灼烧，冷却后才能取菌液B．对于浓度较高的菌液，如甲中的稀释倍数仅为102，则所得的菌落不是由单一的细胞或孢子繁殖而成C．乙中培养皿中所得的菌落都符合要求D．乙中的连续划线的起点是上一次划线的末端答案C解析灼烧后的涂布器如果没有冷却就接触菌种，会将菌体杀死，A正确。稀释倍数过低会导致多个菌体聚集在一起繁殖成菌落，B正确。平板划线法中最后一次划线的末端处形成的菌落才是由单一的细胞或孢子繁殖而成，这种菌落才符合要求，C错误。连续划线中，除了第一次划线外，每一次划线的起点是上一次划线的末端，目的是使得菌体密度越来越小，保证最后划线末端处的菌落是由单一的细胞或孢子繁殖而成。6．稀释涂布平板法是微生物培养中的一种常用的接种方法。下列相关叙述错误的是()6A．操作中需要将菌液进行一系列的浓度梯度稀释B．需将不同稀释度的菌液分别涂布到固体培养基表面C．不同浓度的菌液均可在培养基表面形成单个的菌落D．操作过程中对培养基和涂布器等均需进行严格灭菌处理答案C解析只有菌液稀释到一定程度后，在固体培养基表面才能形成单个的菌落，否则可能会出现两个以上的细菌共同形成一个菌落，或菌落出现重叠。两种纯化细菌的方法的比较项目优点缺点适用范围平板划线法可以观察菌落特征，对混合菌进行分离不能计数适用于好氧菌稀释涂布平板法可以计数，可以观察菌落特征吸收量较少，较麻烦，平板不干燥效果不好，容易蔓延适用于厌氧菌和兼性厌氧菌考点二微生物的筛选和计数1．土壤中分解尿素的细菌的分离与计数(1)分离原理：土壤中的细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成脲酶，这种物质在把尿素分解成无机物的过程中起到催化作用。(2)统计菌落数目：统计样品中的活菌一般用稀释涂布平板法。(3)实验流程：土壤取样→样品的稀释→微生物的培养与观察→细菌的计数。2．分解纤维素的微生物的分离(1)纤维素酶①组成：纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶。②作用纤维素――→C1酶Cx酶纤维二糖――→葡萄糖苷酶葡萄糖(2)纤维素分解菌的筛选①原理纤维素分解菌↓7刚果红纤维素→红色复合物――→纤维素酶红色消失，出现透明圈②筛选方法：刚果红染色法，即通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。③培养基：以纤维素为唯一碳源的选择培养基。④实验流程土壤取样：富含纤维素的环境↓选择培养：用选择培养基培养，以增加纤维素分解菌的浓度↓梯度稀释：制备系列稀释液↓涂布平板：将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上↓挑选产生透明圈的菌落[思维诊断](1)选择培养基可以鉴定某种微生物的种类(×)(2)从物理性状的角度看，选择培养基多属于固体培养基(√)(3)对细菌进行计数只能采用稀释涂布平板法，而不能用平板划线法(×)(4)筛选能分解尿素的细菌所利用的培养基中，尿素是唯一的氮源(√)(5)分解尿素的细菌在分解尿素时，可以将尿素转化为氨，使得培养基的酸碱度降低(×)(6)纤维素是构成植物细胞壁的主要成分，在纤维素酶的作用下，纤维素可以水解成葡萄糖(√)(7)刚果红可以与纤维素形成透明复合物，所以可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌(×)(8)在筛选能分解纤维素的细菌的实验中，选择培养的目的是增大样品中目的菌株的浓度(√)(9)刚果红染色法只能在培养微生物的时候加入刚果红(×)题组一选择培养基成分及配制方法的分析1．选择培养基是根据某一种或某一类微生物的特殊营养要求或对一些物理、化学抗性而设计的培养基。利用这种培养基可以将所需要的微生物从混杂的微生物中分离出来。为选择酵母菌和硝化细菌，应选用的培养基分别为()A．伊红美蓝培养基、含青霉素培养基8B．含青霉素培养基、含氨的无机培养基C．含氨的无机培养基、含青霉素培养基D．含青霉素培养基、伊红美蓝培养基答案B解析酵母菌是真菌，通常可以用含青霉素的培养基进行选择培养，因为青霉素抑制细菌生长，但不能抑制真菌生长。硝化细菌为自养型生物，能够利用氨转变为亚硝酸和硝酸所释放的能量把无机物转变为有机物以维持自身生命活动，利用含氨的无机培养基可进行选择培养。2．苯酚是工业生产排放的有毒污染物质，自然界中存在着降解苯酚的微生物。某工厂产生的废水中含有苯酚，为了降解废水中的苯酚，研究人员从土壤中筛选获得了只能降解利用苯酚的细菌菌株，筛选的主要步骤如图所示，①为土壤样品。请回答下列问题：(1)②中培养目的菌株的选择培养基中应加入________作为碳源，②中不同浓度碳源的培养基________(A.影响；B.不影响)细菌的数量，如果要测定②中活细菌数量，常采用____________法。(2)④为对照，微生物在④中不生长，在⑤中生长，④与⑤培养基的主要区别在于________________________________________________________________________________________________________________________________________________；使用______________________________法可以在⑥上获得单菌落。采用固体平板培养细菌时进行倒置培养的原因是______________________________________________________。(3)实验过程中如何防止其他微生物的污染？_____________________________________________________________________