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1第十单元现代生物科技专题第37讲基因工程[考纲要求]1.基因工程的诞生(Ⅰ)。2.基因工程的原理及技术(Ⅱ)。3.基因工程的应用(Ⅱ)。4.蛋白质工程(Ⅰ)。考点一基因工程的操作工具1．基因工程的概念(1)供体：提供目的基因。(2)操作环境：体外。(3)操作水平：分子水平。(4)原理：基因重组。(5)受体：表达目的基因。(6)本质：性状在受体体内的表达。(7)优点：克服远缘杂交不亲和的障碍，定向改造生物的遗传性状。2．DNA重组技术的基本工具(1)限制性核酸内切酶(简称：限制酶)①来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。②作用：识别特定的核苷酸序列并切开特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。③结果：产生黏性末端或平末端。④下图中的图1和图2分别表示的是EcoRⅠ限制酶和SmaⅠ限制酶的作用示意图。EcoRⅠ限制酶识别的碱基序列是GAATTC，切割位点在G和A之间；SmaⅠ限制酶识别的碱基序列是CCCGGG，切割位点在G和C之间；说明限制酶具有专一性。(2)DNA连接酶2①种类：按来源可分为E·coliDNA连接酶和T4DNA连接酶。②作用：将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。③DNA连接酶和限制酶的关系(3)载体①种类：质粒、λ噬菌体的衍生物、动植物病毒等。②质粒的特点能自我复制有一个至多个限制酶切割位点有特殊的标记基因[思维诊断](1)限制酶只能用于切割目的基因(×)(2)DNA连接酶能将两碱基间通过形成的氢键连接起来(×)(3)E·coliDNA连接酶既可连接平末端，又可连接黏性末端(×)(4)质粒是小型环状DNA分子，是基因工程常用的载体(√)(5)载体的作用是携带目的基因导入受体细胞中，使之稳定存在并表达(√)题组一限制性核酸内切酶、DNA连接酶等酶的作用1．如图为DNA分子在不同酶的作用下所发生的变化，图中依次表示限制酶、DNA聚合酶、DNA连接酶、解旋酶作用的正确顺序是()A．①②③④B．①②④③C．①④②③D．①④③②答案C解析限制酶可在特定位点对DNA分子进行切割；DNA聚合酶在DNA分子复制时将脱氧核苷酸连接成脱氧核苷酸链；DNA连接酶可将限制酶切开的磷酸二酯键连接在一起；解旋酶的作用是将DNA双链解开螺旋，为复制或转录提供模板。2．若要利用某目的基因(见图甲)和P1噬菌体载体(见图乙)构建重组DNA(见图丙)，限制性核酸内切酶的酶切位点分别是BglⅡ(A↓GATCT)、EcoRⅠ(G↓AATTC)和Sau3AⅠ(↓GATC)。下列分析合理的是()3A．用EcoRⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体B．用BglⅡ和EcoRⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体C．用BglⅡ和Sau3AⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体D．用EcoRⅠ和Sau3AⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体答案D解析解答本题的关键是要看清切割后目的基因插入的方向，只有用EcoRⅠ和Sau3AⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体，构建的重组DNA中RNA聚合酶在插入的目的基因上的移动方向才一定与图丙相同。归纳提升确定限制酶的种类(1)根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类①应选择切点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ。②不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ。③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切点)。(2)根据质粒的特点确定限制酶的种类①所选限制酶要与切割目的基因的限制酶相一致，以确保具有相同的黏性末端。②质粒作为载体必须具备标记基因等，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中限制酶SmaⅠ会破坏标记基因；如果所选酶的切点不止一个，则切割重组后可能丢失某些片段，若丢失的片段含复制起点区，则切割重组后的片段进入受体细胞后不能自主复制。题组二载体的作用及特点分析3．下列关于载体的叙述中，错误的是()A．载体与目的基因结合后，实质上就是一个重组DNA分子B．对某种限制酶而言，载体最好只有一个切点，但还要有其他多种酶的切点C．目前常用的载体有质粒、λ噬菌体的衍生物和动植物病毒D．载体具有某些标记基因，便于对其进行切割答案D解析载体必须具备的条件有：①对受体细胞无害，不影响受体细胞正常的生命活动；②具有自4我复制能力，或能整合到受体细胞的染色体DNA上，随染色体DNA的复制而同步复制；③具有一个至多个限制酶切点，以便目的基因可以插入到载体中；④带有特殊的标记基因，如抗生素抗性基因，以便于对外源基因是否导入进行检测；⑤载体DNA分子大小适合，以便于提取和进行体外操作。4．如图是表达新基因用的质粒的示意图，若要将目的基因插入到质粒上的A处，则切割基因时可用的是()A．HindⅢB．EcoRⅠC．EcoBD．PstⅠ答案C解析A处有BamHⅠ、EcoB、ClaⅠ限制酶的切点，使用A～D中的EcoB切割时，才能让目的基因插入到A处。归纳提升载体上标记基因的标记原理载体上的标记基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要转入的受体细胞没有抵抗相关抗生素的能力。当含有抗生素抗性基因的载体进入受体细胞后，抗性基因在受体细胞内表达，使受体细胞能够抵抗相应抗生素，所以在受体细胞的培养体系中加入该种抗生素就可以只保留转入载体的受体细胞，原理如下图所示：考点二基因工程的操作过程与应用及蛋白质工程1．基因工程的操作过程与应用(1)基因工程的操作步骤①获取目的基因—a.从基因文库中获取b.利用PCR技术扩增c.通过化学方法人工合成5②基因表达载体的构建—组成a.目的基因b.启动子c.终止子d.标记基因③将目的基因导入受体细胞—方法a.植物：农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法b.动物：显微注射技术c.微生物：感受态细胞法④目的基因的检测与鉴定a.利用DNA分子杂交技术检测目的基因的有无b.利用分子杂交技术检测目的基因的转录c.利用抗原—抗体杂交技术检测目的基因的翻译d.利用个体生物学水平的鉴定检测重组性状的表达(2)实例分析——抗虫棉的培育①图示：②分析：从图中可以看出，目的基因是Bt毒蛋白基因，使用的载体是Ti质粒，将目的基因表达载体导入受体细胞的方法是农杆菌转化法，请写出两种检测目的基因是否表达的方法：抗原—抗体杂交法、用棉叶饲喂棉铃虫。(3)基因工程的应用：培育转基因植物和转基因动物，生产基因工程药物，进行基因治疗。(4)目的基因导入不同受体细胞的过程生物种类植物动物微生物常用方法农杆菌转化法显微注射技术感受态细胞法受体细胞体细胞或受精卵原核细胞6受精卵转化过程将目的基因插入到Ti质粒的TDNA上→农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞染色体的DNA上→表达将含有目的基因的表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物Ca2＋处理细胞→感受态细胞→重组表达载体DNA分子与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子(5)基因治疗与基因诊断的不同点原理操作过程进展基因治疗基因表达利用正常基因导入有基因缺陷的细胞中，以表达出正常性状来治疗(疾病)临床实验基因诊断碱基互补配对制作特定DNA探针与病人样品DNA混合，分析杂交带情况临床应用2.蛋白质工程(1)流程图：写出流程图中字母代表的含义：A．转录，B.翻译，C.分子设计，D.多肽链，E.预期功能。(2)结果：改造了现有蛋白质或制造出新的蛋白质。(3)应用：主要集中应用于对现有蛋白质进行改造，改良生物性状。[思维诊断](1)抗虫基因即使成功地插入到植物细胞染色体上也未必能正常表达(2014·江苏，23D)(√)(2)应用DNA探针技术，可以检测转基因抗冻番茄植株中目的基因的存在及其完全表达(2011·四川，5D)(×)(3)将人的干扰素基因重组到质粒后导入大肠杆菌，获得能产生人干扰素的菌株(√)(4)利用乳腺生物反应器能够获得一些重要的医药产品，如人的血清白蛋白，这是因为将人的血清白蛋白基因导入了动物的乳腺细胞中(×)(5)为培育抗除草剂的作物新品种，导入抗除草剂基因时只能以受精卵为受体(×)(6)蛋白质工程是在分子水平上对蛋白质分子直接进行操作，定向改变分子的结构(×)(7)目前在抗菌性和溶血性均较强的多肽P1的基础上研发抗菌性强但溶血性弱的多肽药物，首先要做的是依据P1氨基酸序列设计多条模拟肽(2013·广东3C)(√)题组一目的基因的获取及基因表达载体的构建1．下图表示用化学方法合成目的基因Ⅰ的过程。据图分析，下列叙述正确的是()7A．过程①需要DNA连接酶B．过程②需要限制性核酸内切酶C．目的基因Ⅰ的碱基序列是已知的D．若某质粒能与目的基因Ⅰ重组，则该质粒和目的基因Ⅰ的碱基序列相同答案C解析题图所示为化学方法合成目的基因的过程。①②过程依赖碱基互补配对原则进行。质粒和目的基因的碱基序列一般不相同。2．据图表回答问题：限制酶SmaⅠEcoRⅠPstⅠ切割位点CCC↓GGGGGG↑CCCG↓AATTCCTTAA↑GCTGCA↓GG↑ACGTC(1)假设所用的限制酶均能将所识别的位点完全切开，采用EcoRⅠ和PstⅠ酶切含有目的基因的DNA，能得到________种DNA片段。如果将质粒载体和含目的基因的DNA片段只用EcoRⅠ酶切，酶切产物再加入DNA连接酶，其中由两个DNA片段之间连接形成的产物有__________________________、________________________、__________________________。(2)为了防止目的基因和质粒表达载体酶切后的末端任意连接，酶切时应该选用的酶是________、________。答案(1)4质粒载体—质粒载体连接物目的基因—目的基因连接物质粒载体—目的基因连接物(2)EcoRⅠSmaⅠ解析(1)含目的基因的DNA分子上含有2个EcoRⅠ和1个PstⅠ的酶切位点，3个切点全部切开，则形成4种DNA片段。质粒与含目的基因的DNA片段都用EcoRⅠ切割，目的基因两端和质粒的切口处的黏性末端相同，只考虑两个DNA片段相连，则会形成3种连接产物，即质粒与质粒相连、质粒与目的基因相连、目的基因与目的基因相连。(2)为了防止自身环化和任意连接，可选用EcoRⅠ和SmaⅠ两种酶同时切割。归纳提升1．几种目的基因获取方法的比较8方法从基因文库中获取人工合成过程从基因组文库中获取从部分基因文库，如cDNA文库中获取化学合成法反转录法2.基因表达载体中启动子、终止子的来源(1)如果目的基因是从自然界中已有的物种中分离出来的，在构建基因表达载体时，不需要在质粒上目的基因的前后端接上特定的启动子、终止子，因为目的基因中已含有启动子、终止子。(2)如果目的基因是通过人工方法合成的，或通过cDNA文库获得的，则目的基因是不含启动子和终止子的。若只将基因的编码序列导入受体生物中，目的基因没有启动子、终止子，是无法转录的，因此，在构建基因表达载体时，需要在与质粒结合之前，在目的基因的前后端接上特定的启动子、终止子。题组二基因工程的操作及应用实例分析3．下列用于判断目的基因是否转移成功的方法中，不属于分子检测的是()A．通过害虫吃棉叶看其是否死亡B．转基因生物基因组DNA与DNA探针能否形成杂交带C．转基因生物中提取的mRNA与DNA探针能否形成杂交带D．转基因生物中提取的蛋白质能否与抗体形成杂交带9答案A解析分子水平的检测包括三个方面：通过DNA分子杂交检测目的基因是否插入受体细胞染色体的DNA上；通过RNA与DNA杂交，检测目的基因是否转录；通过抗原—抗体杂交，检测目的基因是否翻译。通过害虫吃棉叶看其是否死亡，属于个体生物学水平的检测。4.在某些深海鱼中发现的抗冻蛋白基因afp对提高农作物的抗寒能力有较高的应用价值。如图所示是获得转基因莴苣的技术流程，请据图回答下列问题：(1)获取目的基因的主要途径包括从自然界已有的物种中分离和______________。(2)①过程需要的酶有_____