搜索
第四章食品微生物检验方法手段在食品微生物学检验过程中，需要采用很多方法和手段。下面就几种常用的检验方法作一些基本介绍。一、显微镜检验在食品微生物学检验中，为了能够发现微生物或观察其形态、排列及某些结构，必须借助于显微镜。显微镜观察的微生物标本一般分为两种：染色标本和不染色标本。（一）不染色标本的检验在食品微生物学检验中，检验不染色标本是为了观察微生物细胞在生活时期原有的形态、大小及确定细胞能否运动等。不染色标本的基本制片方法有以下两种：1、压滴法在载波片上加一滴生理盐水，再在其中滴加少许要观察的含菌液体或少量要观察的固体培养物，使菌体均匀分布在生理盐水中，然后盖上盖玻片，即可进行镜检。2、悬滴法将待观察的含菌液体滴在盖玻片上，然后将其反扣在凹玻片上，使液滴悬挂在凹室内。（二）染色标本的检验染色标本是将检验标本根据检验目的，按一定的方法涂片固定，用适当的染料染色而成的标本。经过染色，微生物细胞与其背景的色差增加，镜检时更加清晰可见。染色标本除能显示微生物的形态、排列和一定的构造外，还能显示某些细胞成分的性质及其分布的位置、区别活菌与死菌、鉴定微生物的种类。革兰氏染色法革兰氏染色法卢戈氏碘液媒染1min95%乙醇脱色20-30s番红花红复染1-2min革兰氏染色法呈现第一次染色效果-紫色，革兰氏染色阳性菌呈现第二次染色的效果-红色革兰氏染色阴性菌二、培养检验在食品微生物学检验中，分离培养是一项非常重要的工作，它对进一步确定微生物的种类和研究它们的特性等都具有重要意义。微生物的接种和培养接种工具有：接种针、环、钩、玻璃涂棒、接种圈、接种锄、小解剖刀1．接种针2.接种环3.接种钩4.5.玻璃涂棒6.接种圈7.接种锄8.小解剖刀A划线接种：是最常用的接种方法。即在固体培养基表面作来回直线形的移动就可达到接种的目的。常用的接种工具是接种环、接种针。划线接种是在斜面接种和平板划线中常用的方法。B三点接种（点植法）：在研究霉菌的形态时常用此法。它是把少量的微生物接种在平板表面成等边三角形的三点上，让它各自独立形成菌落来观察研究它们的形态。除三点外，还有一点或多点接种的。C穿刺法接种：在保藏厌氧菌种或研究微生物的动力时常用此法。所用工具是接种针，培养基是半固体培养基。具体做法：用接种针蘸取少量菌种，沿半固体培养基中心向管底作直线穿刺，如某细菌具有鞭毛而能运动，则在穿刺线周围能够生长。D浇混接种（倾注法）：是将待接的微生物先放入培养皿中，然后倒入冷却至45左右的固体培养基，迅速轻轻摇匀，这样菌液就达到了稀释的目的。待平板凝固后，置合适温度下培养，就可长出单个生物菌落。E涂布接种（涂布法）：与倾注法略有不同,即先倒好平板，让其凝固，然后将菌液倒入平板上面，迅速用涂布棒在表面作来回左右的涂布，让菌液分布均匀，就可长出单个的微生物菌落。F液体接种：从固体培养基中将菌洗下，到入液体培养基中，或从液体培养物中用移液管将菌液接至液体培养基中，或从液体培养物中将菌液移至固体培养基中都可称液体接种。G注射接种：是用注射的方法，将待接的微生物转至活的生物体内如人或其他动物中，常见的是疫苗预防接种，来预防某些疾病。H活体接种：是专门用于培养病毒或其他病原微生物的一种方法，因为病毒必须接种于活的生物体内才能生长繁殖。活体可以是整个动物也可以是某个离体的活组织如猴肾，也可以是发育的鸡胚。接种的方式是注射，也可以是拌料喂养。在食品微生物学检验中，根据被检材料的不同和检验步骤中的要求不同，在同一种培养基上可以有不同的接种方法。在进行菌落总数测定时，用的是倾注法接种，再进行各种被检微生物得分离时，常采用划线法接种，虽然他们用的都是琼脂平板，但接种方法各异。食品微生物学检验中常用的接种方法有涂布法、划线法、倾注法、定植法、穿刺法。倾注平板法（2）微生物的培养根据培养时是否需要氧气，可分为好氧培养：这种微生物在培养时，需要有氧气加入，否则不能生长良好，实验是中斜面培养是通过棉花塞从外界获得无菌的空气。三角烧瓶液体培养多数是通过摇床震荡，使外界的空气源源不断的进入瓶中。厌氧培养：这类微生物在培养时，不需要氧气参加。在厌氧微生物的培养过程中，最重要的一定是要除去培养基中的氧气。可采用以下方法除去氧气。（1）降低培养基中的氧化还原电位：常将还原剂谷胱甘肽，硫基酸盐等，加如到培养基中，即可达到目的，有的将一些动物死的或活的组织如牛心羊脑加入到培养基中，也可适合厌氧菌的生长。（2）化合去氧法：主要有焦性没食酸吸收氧气，用磷吸收氧气；用好氧菌与厌氧菌混合培养吸收氧气，用植物的组织如发芽的种子吸收氧气，用产生氢气与氧化合的方法除氧。（3）隔绝阻氧：深层液体培养，用石蜡油封存，半固体穿刺培养（4）替代驱氧：用CO2驱代氧，用氮气驱代氧，用真空驱代氧，用氢气驱代氧，用混合气体驱代氧2．培养结果的观察各种微生物经过培养后，表现出一定特征，这在食品微生物学检验中，是鉴别微生物种类的重要依据。（1）固体培养基上菌落形态特征的观察细菌在固体培养基上，经过一定时间的培养，即可出现肉眼可见的菌落，每种细菌都有一定的菌落形态和特征，主要包括菌落的大小、形状、边缘形态、颜色、透明度等观察菌落的形态特征，通常先用肉眼观察，再用放大镜仔细观察，必要时可用低倍镜观察。（2）液体培养基中培养特征的观察主要是液体的浑浊度是否产生沉淀，液体表面有无菌膜形成，有无附着菌环，培养液的颜色以及是否产气等。（3）半固体培养基中培养特征的观察主要是其是否需氧及其运动情况，是在上部还是在下部深层生长，是沿穿刺线生长还是树根样生长。（三）生化实验各种微生物含有各自独特的酶系统，用于进行代谢活动，在代谢过程中产生的产物也有各自的特点，可借此区别和鉴定微生物的种类。利用这种特点可鉴别微生物。生化试验或生化反应是通过利用生物化学的方法来测定微生物的代谢产物、代谢方式和条件等来鉴别细菌的类别、属种的试验。在进行生化实验时，必须采用纯培养，严禁其他种类的微生物污染，否则会出现错误的结果，生化实验项目很多，应根据检验目的适当选择。1.糖醇类代谢试验此类实验主要用于观察微生物对某些糖类分解的能力以及不同的分解产物，从而进行微生物的鉴定，常见的实验有以下几种（1）糖醇类发酵试验不同的微生物可对各种糖类、醇类等进行分解，但不同的微生物的分解能力和产物都不相同，如大肠杆菌能分解乳糖和葡萄糖（产酸产气），沙门氏菌只分解葡萄糖不能分解乳糖（只产酸不产气）。根据这一特点，在进行大肠菌群测定时，可采用乳糖发酵实验，当大肠杆菌分解乳糖产酸时，培养基内的溴甲酚紫指示剂由蓝紫色变为黄色。乳糖胆盐发酵管产酸产气现象（2）甲基红实验某些微生物如大肠杆菌、志贺氏菌等，在糖代谢过程中能分解葡萄糖产生多种有机酸，酸类增多会使培养物的浓度增大。当培养基的PH低于4.5时，甲基红指示剂是红色（阳性反应）；有些细菌产酸量少，培养基的PH保持在6.2以上，指示剂呈现黄色（阴性反应）（3）V-P试验某些微生物能分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸经缩合、脱羧生成中性的乙酰甲基甲醇，在碱性环境中被空气中的氧气氧化生成二乙酰，在萘酚和肌酸的催化作用下，二乙酰与蛋白胨中所含的胍基成分作用生成红色化合物，即V-P试验阳性。1.糖醇类代谢试验（4）七叶苷水解试验原理：七叶苷被细菌分解后，生成葡萄糖和七叶素，七叶素与Fe2+结合，生成黑色化合物，使培养基呈黑色，以此鉴别细菌。试验方法：将待试纯培养物少许，接种于七叶苷培养基，于36±1℃培养24h,观察结果。结果观察与记录（1）培养基变为黑色或棕黑色者，为阳性，记录为+（2）培养基不变色者，为阴性，记录-（三）生化实验七叶苷水解试验单增李斯特氏菌阳性（5）B-半乳糖苷酶试验有些微生物在含有乳糖或B-半乳糖苷化合物的存在下，产生B-半乳糖苷酶，这种酶具有活力，经一系列反应，使培养物变成深黄色。2、蛋白质及氨基酸代谢试验（1）靛基质（吲哚）试验某些微生物如大肠杆菌、变形杆菌、霍乱弧菌等，含有色氨酸酶，能使培养基中色氨酸水解脱氨生成吲哚，吲哚与对二甲基氨基苯甲醛反应生成红色的玫瑰吲哚而是红色，即吲哚试验的阳性反应。（2）产硫化氢试验（沙门氏菌检验）某些微生物如沙门氏菌、变形杆菌、枯草杆菌、酵母菌等能水解蛋白质中含硫氨基酸（如胱氨酸、半胱氨酸）产生硫化氢，硫化氢与二价铁离子或铅离子生成黑色的硫化铅或硫化铁。2－志贺氏菌3－沙门氏菌4－大肠杆菌（3）尿素酶检验（沙门氏菌检验）某些微生物如普通变形杆菌属、柠檬酸杆菌属、奇异变形杆菌属、沙门氏菌的个别变种能产生尿素酶，分解培养基的尿素而产生氨，使培养基变成碱性，最终粉红色指示剂（酚红）变为红色。（4）氨基酸脱羧酶试验（沙门氏菌检验）某些微生物如沙门氏菌属含有氨基酸脱羧酶，使氨基酸脱羧产生胺类和二氧化碳。胺类的存在使培养基变为碱性而使指示剂变色（溴甲酚紫阳性紫色，阴性黄色，阴性者无碱性产物，但因葡萄糖产酸而使培养基变成黄色）。常用于脱羧酶试验的氨基酸有鸟氨酸、赖氨酸、精氨酸。（5）苯丙氨酸脱氨试验某些微生物具有苯丙氨酸脱氨酶，能将苯丙氨酸氧化脱氨形成苯丙酮酸。苯丙酮酸遇到三氯化铁成蓝绿色。本试验可用于多种微生物的鉴定。（6）明胶液化试验某些微生物能分泌明胶（一种动物蛋白）水解酶（蛋白质）而水解明胶，使经培养后的明胶培养基有原来的固态变为液态。3.呼吸酶类试验（1）硝酸盐还原试验某些细菌能把培养基中的硝酸盐还原为亚硝酸盐或氨或氮等。当加入格里斯试剂后，亚硝酸盐与乙酸反应生成亚硝酸。亚硝酸与对氨基苯磺酸作用形成偶氮苯磺酸，偶氮苯磺酸与α-萘胺结合形成红色的偶氮化合物N-α-荼氨偶氮苯黄酸，即为阳性反应。阴性反应的原因有两个：一是细菌不能还原硝酸盐，则培养后的培养液中仍有硝酸盐的存在；二是细菌将亚硝酸盐还原为氮或氨等物质，则培养基中没有硝酸盐的存在。硝酸盐还原试验操作步骤：接种硝酸盐肉汤，35℃培养5天，加入0.2ml的试剂A,再加入0.2ml的试剂B,轻摇混合。呈粉红色、玫瑰红色、橙色、棕色者表明有亚硝酸盐存在，为硝酸盐还原阳性。若无颜色变化，须加入少量锌粉变红者为阴性（硝酸盐未被还原）不变为阳性（亚硝酸盐已分解成氨和氮）（2）细胞色素氧化酶试验分子氧和细胞色素C，能氧化盐酸二甲基对苯二胺，并和α-萘酚结合，生成吲哚酚蓝（靛酚蓝），是蓝色反应。（3）过氧化氢酶试验过氧化氢酶又称接触酶，能将水分解而释放氧气，大多数好氧或兼性厌氧微生物能产生过氧化氢酶,一般厌氧微生物不产生此酶（如乳酸细菌）触酶试验左侧阳性,右测为阴性对照4.有机酸盐和氨盐利用试验（1）柠檬酸盐利用试验某些微生物（产气杆菌）能利用氨盐作为唯一氮源，同时利用柠檬酸盐作为唯一碳源。他们可在柠檬酸盐培养基上生长，并分解柠檬酸钠而生成碳酸钠，使培养基变为碱性，培养基中的指示剂溴百里酚蓝，由原来的草绿色变为蓝色。（2）丙二酸盐利用试验琥珀酸脱氢酶是三羧酸循环中一个重要环节。丙二酸与琥珀酸会竞争琥珀酸脱氢酶，在丙二酸浓度较高的情况下，琥珀酸脱氢酶不能被释放出来催化琥珀酸脱氢反应，从而抑制了三羧酸循环反应进行，微生物的生长也受到了抑制，也有些微生物在丙二酸钠培养基上能够生长，使培养基变为碱性，溴百里酚蓝，由原来的草绿色变为蓝色，说明这些微生物能够利用丙二酸盐。5.毒性酶试验（1）卵磷脂酶试验有些微生物能产生卵磷脂酶，即X-毒素，在有钙离子存在时，能迅速分解卵磷脂，生成脂肪和水溶性磷酸胆碱，当这些微生物在卵黄胰胨培养液中生长时，可出现白色沉淀（脂肪）。（2）血浆凝固酶试验致病性葡萄球菌（金黄葡萄球菌）能产生血浆凝固酶，他们可直接作用于血浆中的纤维蛋白，也可作用于血浆凝固酶原，是之成为血浆凝固酶，从而使抗凝的血浆发生凝固，这是鉴定致病球菌的重要指标,是否是致病球菌主要看它是否产生凝固酶.有凝块均匀混浊均匀混浊生理盐水金黄色葡萄球菌血浆凝固酶实验（3）链激酶试验A型溶血链球菌能产生链激