纳米级生物分子测量的新方法和新技术

纳米级生物分子测量的新方法和新技术肖忠党国家教育部分子与生物分子电子学重点实验室东南大学，吴健雄实验室东南大学，生物科学与医学工程系杭州2003.9.13主要内容生物分子测量的常规手段生物分子测量技术的发展生物单分子测量的新技术存在的问题及展望X射线衍射中子衍射法分子晶体核磁共振法园二色谱法荧光光谱法喇曼光谱法小角散射溶液状态生物分子生物分子空间结构测量生物分子测量的常规手段生物分子空间结构测量各种显微镜技术荧光显微镜激光共聚焦显微镜电子显微镜扫描探针显微镜近场光学显微镜生物分子动力学测量核磁共振法园二色谱法荧光光谱法喇曼光谱法小角散射快速混合停流谱（MixingStopped-flowSpectroscopy）时间分辨波谱等等慢反应过程（分钟级）快反应过程（毫秒级）（如蛋白质折叠）常规生物分子测量技术的局限性有限的时间分辨率分子测量结果为很多分子的平均有限的空间分辨生物分子测量技术的发展1、第三代同步辐射波谱技术光束线出口在CCD探测器上成像的单色光斑蛋白晶体衍射图样同步辐射光具有高亮度、高度单色、高度准直，高稳定性，以及宽波谱等优点，同步辐射波谱具有更高的灵敏度和良好的空间分辨率中科大国家同步辐射实验室第二代同步辐射北京高能所同步辐射装置第一代同步辐射、超快混合连续流动谱技术Comparisonofexperimentalmethodsfordetectionoffastproteinfoldingreactionsandtheiraccessibletime-scalesBieriO.,KiefhaberT.,Biol.Chem.380(1999)923温度跃变只适用于肽类和极少数在合适温区发生冷变形的蛋白质分子光化学触发需要给蛋白质分子结合上特殊的光敏基团NMR迟豫以及压力跃变方法只适合分子折叠的转变态为什么选择超快混合连续流谱技术？1）超快混合技术是一种通用的手段2）应用超快混合连续流谱技术可以在非常接近蛋白质分子天然状态的情形下研究其折叠过程BieriO.,KiefhaberT.,Biol.Chem.380(1999)923连续流动超快混合反应光谱仪结果图Figure3Deadtimecalibrationofthemixer.(a)PlotofthefluorescencequenchingreactionofNATAbyNBSatdifferentfinalNBSconcentration.[NATA]final=20m.(b)Thesolidlineisafittotheplotofthepseudo-first-orderrateconstantsasafunctionofNBSconcentration.Thisyieldsthesecond-orderrateconstantsfortheNATA-NBSreactionof6.8X10-5M-1S-1.超快混合连续流谱技术研究免疫球蛋白Im7的折叠中间体Im7是由53个氨基酸组成的免疫球蛋白分子，具有四个螺旋结构。已经证明其折叠只有一个中间态，但是其折叠途径可能有两个模型。Figure4.FluorescencechangesduringthefoldingofIm7.Dataonthemicrosecondtime-scalewereacquiredusinganovelmicrocapillarycontinuous-flowrapidmixingdeviceequippedwithaUVsensitiveCCDcamera(builtbyShastryandRoder).Thesedatawerethennormalisedandcombinedwithstopped-flowdataonamillisecondtimescaletocovertheentiretime-courseofIm7folding.Thecombineddataatawiderangeofureaconcentrations(tworepresentativeconcentrationsareshownaslabelled)werethenfittedsimultaneouslytoavarietyofthree-statekineticmodels.Theblacklinesshowthetime-coursepredictedfromthebestfittoanon-pathwaymodel(seetext).Theredlinesshowthetime-coursepredictedfromthebestfittotheoff-pathwaymodel.正在继续和计划的研究课题验证其他免疫球蛋白的折叠特性研究序列的改变对免疫球蛋白折叠的影响改进微型混合器及检测系统进一步提高灵敏度和降低死时间3、单分子技术为什么要研究生物单分子？单个生物分子行为更可能反应生命的本质现象现有的系综研究方法不能揭示生物分子的个体行为生物单分子研究的技术支持扫描探针显微镜技术（原子力显微镜）近场光学技术光镊技术操纵检测力性质表面形貌特异性生物单分子测量的新技术光镊技术利用激光光束的梯度压力扫描探针显微镜技术（原子力显微镜）近场光学技术生物单分子的研究方法举例霍乱毒素(80nm)“Y”型IgG抗体分子(250nm)鲁米诺分子叠放在膀胱上皮细胞表面(16nm)原子力显微镜直接获得生物单分子的空间结构=1&Submit=GO近场光学显微镜探测双色标记的单个DNA分子HaT.,etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,93(1996)6264全内反射荧光显微镜直接观察到活细胞表面标记的单个分子移动UedaM,etal.,Science,294(2001)864BustamanteC.,BryantZ.,SmithS.B.,Nature,421(2003)423光钳技术研究DNA单分子的力学性质光钳技术研究单个Titin蛋白分子的折叠/去折叠转换KellermayerM.,SmithS.B,etal,Science,276(1997)1112AFM研究单个多聚糖链的弹性RiefM,etal.,Science275(1997)1295AFM研究单个视紫红质去折叠途径OesterheltF.etal.,Science288(2000)143AFM研究单个DNA分子解链和复链过程AlbrechtC.,etal.,Science301(2003)367KrauthauerR.,NanoLett.,3(2003)493结合荧光共振能量传递技术研究单个生物分子行为WeissS.Science,283(1999)1676生物单分子研究存在的关键问题空间分辨率低对单个生物分子的操控不成熟100m血红细胞核小体与DNADNA片断与RNA聚合酶分子的转录识别染色体=1&Submit=GO我们的工作和设想（1）高分辨AFM针尖AFMcantileverAFMtipTipapex~10nmMulti-functionaltipmoleculeProteinresistantlayerSiXRRRRRRRRRRRRSiSi(OEt)3Si(OEt)3Si(OEt)3SiSi(EtO)3Si(EtO)3SiSi(OEt)3SiSi(OEt)3Si(OEt)3Si(OEt)3Si(EtO)3Si(EtO)3Si(EtO)3SiSiSiSi(OEt)3Si(OEt)3(EtO)3SiSi(EtO)3Si(EtO)3Si(EtO)3SiSi(EtO)3SiSi(OEt)3Si(OEt)3SiSiSi(OEt)3Si(OEt)3Si(OEt)3Si(EtO)3Si(EtO)3Si(EtO)3SiNHNOHOOHOOOHOOOOOOOOONHOONHSi(OEt)3Si(OEt)3Si(OEt)3Si(OEt)3RONH2NHSHNNHOO1an?131bn?332aR=SNHNHO2bR=2cR=(CH2)11SAc3X=NHBoc,(CH2CH2O)nNHBocR=OEGOnOOOOOO(EtO)3Si(EtO)3Si(EtO)3SiSi(OEt)3OnLieberC.M.,et.al,Nature,398(1998)761LieberC.M.,et.al,J.Am.Chem.Soc.,120(1998)603型淀粉纤维IgM分子一个设想：纳米管针尖Ajayan,P.M，Chem.Rev.，99（1999）1787现有制备纳米管AFM针尖方法的缺点由于无法控制生长点的位置及大小，生长方向也随机，因此制备的纳米管针尖容易是复壁型，更容易形成多针尖，所以制备效率很低提高AFM的分辨率减少连接到针尖上的数目（2）单分子AFM针尖目标：真正意义上控制生物单分子研究SiAFMtipSelectiveactivationOEG-coatingTipmoleculeStickybaseFunctionalgroupSMAT思路与方案ChiMingYam,ZhongdangXiao,JiahuaGu,SabineBoutet,andChengzhiCai,J.Am.Chem.Soc.,125(2003)7498ChiMingYam,ZhongdangXiao,JiahuaGu,SabineBoutet,andChengzhiCai,J.Am.Chem.Soc.,125(2003)7498定点活化方法选择ZhongdangXiao,ChiMingYam,SabineBoutet,ChengzhiCai“ActivationofSelectiveAreaontheTopofAtomicForceMicroscopyProbe”,J.Am.Chem.Soc.,submitted.初步实验结果已显示此方法可有效地控制活化尺寸小至几个纳米几个构想AFM操纵生物单分子与荧光技术结合推广方法到其他探针，如光钳的颗粒，SNOM探针等探测活细胞内生物单分子的行为生物单分子的特定功能检测大面积扫描探针显微用于纳米操纵存在的问题及展望空间和时间分辨率还远远不够如何在测量结果中去除引入外界因素的影响生物单分子的个体行为与生命现象的本质关系还缺乏行之有效的活细胞内生物分子实时测量方法测量的结果和生物分子的特定功能之间关系Thanks！