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@100biotech.com实验六细胞凋亡小体和梯状DNA的观察一、实验目的1掌握诱导细胞凋亡和观察细胞凋亡小体的方法2掌握DNA电泳检测方法，证明凋亡细胞DNALadder的存在。细胞死亡作为生物体的一种常见现象，一般可分为两种类型：细胞坏死（necrosis）和细胞程序性死亡（programmedcelldeath，PCD）。后者也称细胞凋亡（apoptosis）。细胞坏死是细胞在遭受极度刺激时引起的细胞死亡，以细胞质膜的破裂为特征，造成内含物的炎性泄露，是一种非正常死亡。细胞凋亡是细胞的一种“主动性”死亡行为，由基因控制，表现为细胞染色质凝集并边缘化、细胞浓缩、凋亡小体产生及DNA片段化等。由于片段化而形成的DNALadder被认为是细胞凋亡的典型特征。细胞程序性死亡被分为两类：受体介导的细胞程序性死亡和线粒体介导的细胞程序性死亡。本实验主要涉及到线粒体介导的凋亡途径。线粒体可以进行氧化磷酸化并产生ATP，同时它还可以诱导产生PCD发生的物质-细胞色素C（cytC）的泄漏。线粒体膜上存在Bax组成的孔道。Bcl-2等抑制它的开放，从而抑制PCD因子的释放和阻止PCD的发生。而Bad等促进Bax开放，从而导致Apaf:apoptosisproteaseactivatingfactor活化，使cytC的释放，促进CytC,Apaf-1,caspase-9复合物的形成，使得细胞处于细胞凋亡的执行阶段（见图10-7）。凋亡的标准特征之一，是基因组DNA断裂为180-200bp的多条寡核小体片段。此现象可用常规琼脂糖凝胶电泳检测，是凋亡的特征。DNA梯状序列最后可在紫外灯下显示，人们可以照像记录它的电泳行为。根据DNA的电泳行为，人们就可以判断出细胞死亡的类型。凋亡细胞形成明显的梯状DNA，坏死细胞为不清晰弥散状DNA，而活细胞DNA在琼脂糖凝胶的顶部，是一个没有受到切割的高分子量条带。二、实验原理Cytc是电子传递链的重要组成部分，定位于线粒体内，是真核细胞内不可缺少的重要因子。但当他溢出线粒体后就会诱导细胞凋亡。在本实验中，对洋葱内表皮、烟草悬浮细胞或人口腔内皮细胞等加入Cytc或其他诱导物，观察诱发产生的凋亡细胞。用改良苯酚品红染色观察凋亡细胞核发生染色质凝集（condensation）、趋边化(margination)、DNA裂解（fragmentation）产生凋亡小体等形态学上的变化，用琼脂糖凝胶DNA电泳检测细胞凋亡后形成的DNALadder。@100biotech.com三、材料、试剂和仪器1．材料采用的烟草悬浮细胞株系、洋葱内表皮和人口腔内皮细胞。2．试剂的配制：@100biotech.com1）烟草悬浮细胞的基本培养基2）100μmol/lCytc的水溶液3)170nmol/L或230nmol/L的CaCl24）改良苯酚品红染色先配母液A和B。母液A称取3g碱性品红，溶于100mL的70%酒精中（此液可长期保存）。母液B:取母液A10mL，加入90mL的5%石碳酸水溶液（2周内使用）。苯酚品红染色液：取母液B45mL，加入6mL冰乙酸和6mL37%的甲醛。改良苯酚品红染色：苯酚品红染色液2-10mL，加入90-98mL45%的醋酸和1.8g山梨醇。此染液初配好时，颜色较浅，放置二周后，染色能力显著增强，在室温下不产生沉淀而较稳定。5）1%的琼脂糖凝胶6）2ⅹCTABbuffer：2％（w/v）CTAB、100mmol/LTris-HCl(pH8.0)、20mmol/LEDTA、1.4mol/LNaCl、1％PVP、7)氯仿:异戊醇(24：1)四、实验程序1．取样1）直接撕取洋葱内表皮和刮取人口腔上皮细胞2）烟草悬浮细胞的培养烟草(Nicotianatabacum)悬浮细胞在改良的MS液体培养基（内含MS基本培养基,KH2PO4200mg/L，2，4-D1ml/L，Gly1.8mg/L，VB10.6mg/L）中继代培养，每7天继代一次，培养基pH5.8，110rpm/min摇床振荡，25℃悬浮培养。2．细胞凋亡的诱导1）Cytc处理：共做三组样品。试验组样品要先经Cytc处理，浓度为12.5μmol/L，如实验材料为人口腔上皮细胞，时间为1hr左右，如是洋葱内表皮或烟草悬浮细胞时，时间控制为48hr左右；正对照样品不需处理，为正常生长的细胞；负对照样品是将正常的细胞煮沸30min，使其坏死。在具体做实验时，也可以采用不同浓度的Cytc进行处理：（1）Cytc诱导人口腔上皮细胞的凋亡步骤：①涂片；@100biotech.com②漂洗均参照细胞骨架实验的操作；③处理：浸泡于三种不同浓度的CytC溶液中；④分别于1hr后分时间段取出，用改良苯酚染液染色30min；⑤镜检观察。（2）细胞色素C诱导的洋葱内表皮细胞凋亡步骤：①将洋葱内表皮切成1cm2的小块，浸泡于三种不同浓度的CytC溶液中；②48hr后用改良苯酚染液染色30min，洗去表面染料，放在载玻片并压片；③镜检。2）高浓度Ca2+的处理：170nmol/L或230nmol/L的CaCl2处理材料1hr左右，样品操作方法同上。3．形态学观察在显微镜下观察细胞形态并对试验组细胞进行凋亡率统计。随机选取5个视野，统计总细胞数和凋亡细胞数（以细胞核染色质出现明显的边缘化凝集为标志），计算凋亡率（%）=（凋亡细胞数/总细胞数）×100%。最后在普通光镜下照相。4．基因组DNA的提取对以上三组不同处理的样品分别进行基因组DNA的提取（方法参见第一章，实验2），并进行1%琼脂糖凝胶电泳的检测。五、结果与分析1．形态学变化烟草悬浮细胞系BY-2的对照组细胞胞质透明，核圆形且周围有许多颗粒状物质分布，细胞多聚集成团（见图8-2A，C）。实验组BY-2经12.5μmol/LCytc处理48hr后，显微镜下均可见细胞染色质明显聚集在核膜边缘、形成凋亡小体，细胞胞质内均匀分布着碎末状物质，细胞分散均匀，不成团状（见图8-2B,D）。在光镜下可以观察到高钙诱导的细胞凋亡现象为，细胞核内染色体出现明显的聚集现象，见图8-3。@100biotech.com2．琼脂糖凝胶电泳结果经细胞凋亡诱导的细胞，分别提取总DNA。然后经1%的琼脂糖凝胶电泳，在紫外投射仪上观察。经Cytc处理不同时间细胞的DNA出现了不同断裂程度的DNALadder。六、思考题1．请思考细胞色素C诱导细胞凋亡产生凋亡小体的过程？2．凋亡细胞中产生DNAladder的原因是什么？参考文献：@100biotech.com1.李素文2001细胞生物学实验指导.高等教育出版社2.李宗根2003生物化学与生物技术，人民卫生出版社3.李艳红，马小娟，柴小清.1999H2O2诱导烟草悬浮细胞的凋亡.首都师范大学学报.44(11)4.林颖，刘玉良，2000细胞骨架光镜制片的简便方法，JournalofFujianMedicalUniversity,,34:265.刘文娜，汪矛，李重九.2002植物细胞程序化死亡研究进展.植物学通报19（5）：546~5516.王新宇等，1993洋葱鳞茎表皮Actin细胞骨架的Rh－Ph荧光和光学显微镜观察，西北植物学报13（2）：114－1187.王庆华，邓文君，李艳红.2004细胞色素c(Cytc)诱导烟草悬浮细胞（BY-2）凋亡.植物生理学通讯2004，12：666-6688.印莉萍，刘祥林等2001分子细胞生物学实验技术，首都师范大学出版社9.赵刚，刘建中2001医学细胞生物学实验与习题，科学出版社10.赵允，孙丽英，蒋争凡，翟中和2002细胞色素C诱导胡萝卜细胞核的体外凋亡.科学通报11.周先碗，胡晓倩2003生物化学仪器分析与实验技术，化学工业出版社12.奥斯伯等1998精编分子生物学实验指南科学出版社13.Karp.GCellandMolecularBiology.ThiedEdition.影印版，2002高等教育出版社14.YongmingLiandYiqiZhao1996ProcticalprotocolsinMolecularBiology.SciencePressBeijing,NewYork