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2016年《基因工程技术》课程复习题1.名词解释（占25%，10个名称解释，从12个名词中选10个）基因工程：按照人们的愿望，依据严密的设计，通过体外DNA重组、转基因、基因编辑（CRISPR／Cas9）等技术，有目的地改造生物物种特性，创造出更符合人类需求的新的生物类型的研究领域。DNA复性与变性：变性是指核酸双螺旋碱基对的氢键断裂，双链变成单链，从而使核酸的天然构象和性质发生改变。变性时维持双螺旋稳定性的氢键断裂，碱基间的堆积力遭到破坏，但不涉及到其一级结构的改变。复性指变性DNA在适当条件下，二条互补链全部或部分恢复到天然双螺旋结构的现象，它是变性的一种逆转过程。PCR：在模板、引物、4种dNTP和耐热DNA聚合酶存在的条件下，通过酶促合成反应特异扩增位于两端已知序列之间的DNA区段。Tm值：DNA熔解温度，指把DNA的双螺旋结构热变性过程中紫外吸收值达到最大值的1/2时的温度。不同序列的DNA，Tm值不同。DNA中G－C含量越高，Tm值越高，成正比关系。限制性内切核酸酶：指能够识别双链DNA分子中特定核苷酸序列，并在每条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键进行切割的一类酶，简称限制酶。粘性末端：被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，它们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。同裂酶：指一些来源不同的能识别同样的核苷酸靶子序列的限制性内切酶。同裂酶的切割位点可能不同，识别序列和切割位点都相同的叫同序同切酶，识别序列相同但切割位点不同的叫同序异切酶。同尾酶：指来源不同且识别靶子序列也不同但能产生出相同的黏性末端的限制性内切酶。末端酶或Ter体系：在病毒DNA包装过程中，催化特异性地切割病毒DNA连环体，产生单位长度的基因组，并参与基因组包装的酶类。DNA连接酶：也称DNA黏合酶，催化相邻核苷酸的游离5’-磷酸基团和3’-羟基之间形成磷酸二酯键的核酸酶。连接酶的催化作用需要消耗ATP。DNA修饰酶：泛指能够参与改变DNA组成和结构的一类酶。DNA聚合酶：是指催化以DNA单链为模板，以4种脱氧核糖核苷酸为底物，合成一条与模板链序列互补的DNA新链的酶。以DNA为复制模板，从将DNA由5'端点开始复制到3'端的酶，是细胞复制DNA的重要作用酶。载体：是一种具有特定功能能自我复制的DNA分子，能将外源DNA片段携带进入受体细胞，并在受体细胞中稳定维持和表达。质粒载体：一种裸露的、比病毒更简单的，有自主复制能力的双链超螺旋共价闭环DNA分子（简称cccDNA）。在由限制性核酸内切酶修饰过的质粒DNA序列中插入外源的目的基因，以质粒为载体，将目的基因通过转化或转导的方法导进宿主细胞，进行重组、筛选、扩增的过程。柯斯质粒载体：是一类人工构建的含有λDNA的cos序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体。由三个部分组成：含有一个pBR322的完整复制子，两个抗性基因AmpR和TetR及一个带有λ噬菌体cos序列。噬菌体载体：噬菌体是一类感染细菌病毒的总称，在噬菌体DNA分子中，除具有复制起点外，还有编码外壳蛋白质的基因。噬菌体主主要有双链噬菌体和单链丝状噬菌体两大类。双链噬菌体为λ类噬菌体，单链丝状噬菌体有M13、f1、fd噬菌体。重组DNA技术中常用的噬菌体克隆载体主要有λ类噬菌体和M13噬菌体。温和噬菌体：具有溶原周期的噬菌体。在短时间内不能连续完成吸附、侵入、增值、成熟和裂解这五个阶段而实现繁殖的噬菌体为温和噬菌体。烈性噬菌体：只有溶菌周期的噬菌体。烈性噬菌体也称为毒性噬菌体，噬菌体的繁殖一般分为5个阶段，即吸附、侵入、增殖、成和裂解。凡在短时间内能连续完成以上5个阶段而实现其增殖的噬菌体，称为烈性噬菌体。溶原周期：指在感染过程中没有产生出子代噬菌体颗粒，但是噬菌体DNA整合到寄主细胞的染色体DNA上，成为染色体DNA的一个组成部分。溶菌周期：噬菌体吸附到寄主细胞表面之后，注入DNA，噬菌体的DNA进行复制及蛋白质的合成，并组装成噬菌体颗粒，最后使寄主细胞裂解，释放出子代噬菌体颗粒的过程。体外包装：在离体条件下，用噬菌体或病毒的蛋白质包裹噬菌体或病毒的裸核酸，组装成有感染性的噬菌体或病毒颗粒的过程。Ti质粒：在根瘤土壤杆菌细胞中存在的一种染色体外自主复制的环形双链DNA分子。它控制根瘤的形成，可作为基因工程的载体。是致癌农杆菌的一种内源质粒，当农杆菌接触感染植物时，能引发植物产生肿瘤即冠瘿瘤。根据合成不同的冠瘿碱类型，Ti质粒可以分为章鱼碱型、胭脂碱型、农杆碱型和琥珀碱型等。是一种双链环状DNA分子，200-250kb，可分为4个功能区：T-DNA区、Vir毒性区（调控T-DNA转移区）、Con区（接合转移编码区）和Ori区。SV40：是猴空泡病毒40，猿猴病毒40或猴病毒40的缩写，多瘤病毒科，这是在人类和猴子都发现的致瘤病毒。SV40的基因组是一种环形双链的DNA，很适于基因操作。SV40病毒有三种外壳蛋白质VP1、VP2和VP3，包装着一条5.2kb的环状基因组DNA。根据其基因组的表达时间不同，把基因组分为早期表达区和晚期表达区。早期表达区编码T-抗原和t-抗原，当T-抗原达到一定浓度时，开始启动病毒DNA复制；晚期表达区编码三种外壳蛋白质，外壳蛋白质在复制后一段时间内表达。穿梭载体：含有病毒完整早期区段和复制起点同大肠杆菌的质粒分子重组而构建的，既能在哺乳动物细胞复制增殖，也可以在大肠杆菌中复制增殖。指含有两个亲缘关系不同的复制子，能在两种不同的生物中复制的。这类载体不仅具有细菌质粒的复制原点及选择标记基因，还有真核生物的自主复制序列以及选择标记性状，具有多克隆位点。cDNA文库：以mRNA为模板，经反转录酶催化，在体外反转录成cDNA，与适当的载体连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，并能繁殖扩增，这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的cDNA文库。基因组文库：把某种生物基因组的全部遗传信息通过克隆载体贮存在一个受体菌克隆子群体中，这个群体即为这种生物的基因组文库。感受态细胞：理化方法诱导细胞，使其处于最适摄取和容纳外来DNA的生理状态。Southern印迹杂交：利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性内切酶消化的DNA片段，将胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤或者紫外线照射固定，再与相对应结构的标记探针进行杂交，用放射自显影或酶反应显色，从而检测特定DNA分子的含量的技术。转染作用：将纯化的含有靶基因的质粒DNA送入细胞内，并在细胞内表达。转化作用：将携带某种遗传信息的DNA分子引入宿主细胞，通过DNA之间同源重组的作用，获得具有新遗传性状生物细胞的过程谓之转化作用。转导作用:当病毒从被感染的细胞释放出来，再次感染另一细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基因重组即为转导作用。操纵子：指包含结构基因、操纵基因以及启动基因的一些相邻基因组成的DNA片段，其中结构基因的表达受到操纵基因的调控。主要见于原核生物，但在真核生物中也存在。启动子：位于结构基因5'端上游的DNA序列※，是指位于转录起始点上游的特异序列（通常位于基因转录起点上游的100bp范围内，长约20-200bp），是转录起始时RNA聚合酶识别和结合的部位，与转录的启动有关，但本身并不转录。启动子的结构可以影响它与聚合酶的亲和力，从而影响表达水平。多顺反子：多顺反子见于原核生物意指一个mRNA分子编码多个多肽链。这些多肽链对应的DNA片段则位于同一转录单位内，享用同一对起点和终点。增强子：是一段能增强启动子转录效率的特定序列，从而明显地提高基因转录的效率。特点：①远距离调控②无方向性信号肽：在起始密码子后，有一段编码疏水性氨基酸序列的RNA区域，该氨基酸序列就被称为信号肽序列，它负责把蛋白质引导到细胞含不同膜结构的亚细胞器内。密码子偏好：是指各种生物体偏爱使用三联密码子（即编码相同氨基酸的密码子）的现象。基因表达：细胞在生命过程中，把储存在DNA顺序中遗传信息经过转录和翻译，转变成具有生物活性的蛋白质分子。此处指外源基因在受体细胞中从mRNA转录到功能蛋白质翻译的过程。Pribnow框：原核生物中，在启动子上游有一个由5-6个核苷酸组成的共有序列，以其发现者的名字命名为Pribnow框。SD序列：原核生物mRNA起始密码AUG（相应DNA上的起始密码ATG上游约-10处）的上游约4-7个核苷酸之前有一富含嘌呤的5′-AGGAGGU-3′的短小序列，称为SD序列（ShineDalgarnosequence），能与细菌16SrRNA3’端识别，帮助从起始AUG处开始翻译。2.判断题（占5%，5个判断题）3.选择题（占10%，5个选择题）4.问答题（占60%，6个选择，从8个选择中选6个）简述基因工程的基本技术路线？分离目的基因：从生物有机体的基因组中分离出带有目的基因的DNA片段；体外目的基因和载体重组：在体外，将带有目的基因的DNA片段连接到能自我复制并具有选择标记的载体分子上，形成重组DNA分子；转化受体细胞：将重组DNA分子转化到寄主细胞中；扩大培养（按需）：重组体在细胞中扩增繁殖，获得大量的细胞繁殖菌落；检测筛选转化细胞：从菌落中，筛选出重组DNA分子克隆菌落；研究与鉴定：将选出的克隆菌落进一步研究分析，使目的基因的功能在细胞水平上表达。生产应用简述基因工程有哪些主要研究内容与应用领域?研究内容：基础研究：克隆载体系统研究、工具酶系统研究、受体系统（即表达系统）研究、目的基因功能及其调控机制研究、基因重组及修饰技术研究、基因组学研究等应用研究：基因工程药物研究（医学领域）、转基因植物研究（种植业领域）、转基因动物研究（畜牧业领域）、其他方面研究（食品、化工、能源、环境等）应用领域：医学领域：基因工程药物、基因治疗、基因芯片农业领域：转基因植物、转基因动物能源环境领域：转基因能源植物（玉米、木薯、红薯等）、转基因超级细菌和制剂（粪便污染、油污、重金属、塑料）军事领域：基因武器简述提取天然DNA的基本步骤及其主要方法？生物材料的准备：动物和人DNA样品的采集与保存：主要是血样和组织样，冷冻保存、甲醛乙醇等防腐保存；植物DNA样品的采集与保存：主要有根、茎、叶、花果等组织器官，采集时避免有病虫害、损伤的组织器官，将材料清洗用无菌吸水纸吸干保存或冷冻保存；细菌DNA样品的制备：通过合适的培养基进行细菌增殖，获得菌液或菌落，离心收集菌体，冷冻保存；病毒或噬菌体DNA样品的制备：由于病毒或噬菌体寄生于细胞内，必须从宿主细胞中分离，过程相当复杂。细胞裂解：CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）裂解法、SDS裂解法（十二烷基磺酸钠）、蛋白酶K裂解法、液氮冻融DNA的分离和抽提：酚-氯仿抽提法、盐析法、氯化铯密度梯度离心法、固相萃取法纯化和浓缩：在抽提DNA溶液中往往含有少量的RNA、蛋白质及实验试剂残留物，必须去除进一步纯化DNA：RNase处理：加入适量的RNase在常温条件下放置几分钟就可以降解DNA溶液中的RNA。琼脂糖凝胶电泳洗脱法：用于少量的DNA纯化。氯化铯-溴化乙锭连续梯度离心法：大量的DNA纯化。离子交换层析法：由于DNA磷酸基团与固相阴性交换离子相互作用，DNA能结合在层析柱固体介质（羟基磷灰石、层析树脂）上，然后再用一定浓度梯度盐溶液洗脱。基因组DNA的沉淀：用0.1倍体积的3MNaAc（乙酸钠）或2.5倍体积的100%乙醇沉淀DNA,用70%乙醇除去DNA沉淀中的盐离子。基因组DNA的溶解与保存：将基因组DNA溶解在TE缓冲液中，置4C保存。制备基因组DNA时应注意：防止内源性DNase保证得到高分子量的基因组DNA保证基因组DNA不被蛋白质和实验残留物所污染阐述PCR引物设计原则有哪些？引物长度适中，一般为18~30个核苷酸：引物过短会使PCR的特异性降低，过长会提高相应的退火温度，并使延伸温度超过TaqDNA聚合酶的最适温度72℃，亦会影响产物的生成，且合成引物的成本增加。引物中的碱基尽可能随机分布：避免出现嘌呤，嘧啶的堆积现象。尤其是引