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12主要内容第一节细胞大规模培养第二节动物细胞制药第三节植物次生代谢产物的生产3第一节细胞大规模培养大规模培养技术是建立在实验室培养方法（贴壁培养法和悬浮培养法）的基础上，再利用固定化细胞、人工灌注、生物反应器技术等技术发展起来的。一、细胞培养的操作方式二、大规模细胞培养系统4一、细胞培养的操作方式培养方式分为：分批式流加式培养半连续式连续灌注式51、分批式培养指先将细胞和培养液一次性装入反应器内进行培养，细胞不断生长，产物不断形成，经一段时间后，终止培养。6分批式培养特点①系统密闭，只允许气体和挥发性代谢物质与外界交换。②培养基体积固定，当主要营养物质耗尽时，细胞即停止生长，又称为分批培养或间歇培养，多在3-5d/批。③细胞数目、总重量、DNA含量呈“S”形(五个时期)变化。④为保证细胞不断增殖，须在达到最大重量时取出1/5～1/3的培养液，转移继代培养。⑤是传统的、常用的方法，可直接放大。其工业反应器规模可达12000L。82、半连续式（流加式）培养指在分批式培养的基础上，将分批培养的培养液部分取出，并补充加入等量的新鲜培养基，使反应器内培养液的总体积保持不变。93、流加式培养在分批式操作的基础上，在培养过程中根据细胞对营养物质的不断消耗和需求，流加浓缩的营养物或培养基，从而使细胞持续生长至较高的密度，目标产品达到较高的水平。由于流加式培养能控制更多的环境参数，使得细胞生长和产物生成容易维持在优化状态，是当前动物细胞培养工艺中占有主流优势的培养工艺。104、连续灌注式培养是把细胞接种后进行培养，新鲜的培养液不断从反应器一头加入，从另一头不断取出等量的培养液，细胞仍留在反应器内，使细胞处于一种营养不断供应状态。使反应条件处于一种恒定状态。11连续灌注式培养特点1）不断加入新培养基，保证了营养物质的充分供应。2）培养期细胞增殖速度快，细胞生长速率长久地保持在对数生长期，形成一个稳定的培养状态。3）适用于细胞大规模工业化培养。4）由于连续培养需要的设备比较复杂，投入较大，且要维持细胞无菌状态，技术条件要求苛刻，因此未得到广泛应用。1213开放式连续培养----细胞随排出培养液一起流出且速度恒定。在稳定状态下流出细胞的速率等于培养系统中新细胞的增长速率。封闭式连续培养----新鲜培养液和老培养液以等量方式进出，而收集的细胞重新放入原培养系统中继续培养，故培养系统中细胞数量是在不断增加的。1415二、大规模细胞培养方法按供养方式分为三种：搅拌式、气升式、旋转式按细胞固定分为四种：悬浮培养、微载体培养、微囊化培养、微导管培养（中空纤维培养）。16机械搅拌式(Spinner)机械搅拌式主要是通过不锈钢搅拌系统使培养物的混匀。在罐体顶端有一些传感器，监测培养物的温度、pH值、溶氧度(DO)、葡萄糖消耗、NH3、NH4+等参数。这种反应器培养规模可达2000L。17该系统优点：（1）设计简单，操作方便，易于放大生产；（2）细胞密度高，达到107/mL以上；（3）便于无菌操作，不易污染；（4）氧的转换率高，能满足细胞在生长时所需的要求。缺点：对细胞损伤较大，产物含量不高。18气升搅拌式气体从罐底的喷射管进入反应器的导流管。湍流温和而均匀，循环量大，细胞与培养液混合均匀。剪切力小，细胞的伤害小。喷射供氧，氧传递速率高，供氧良好。适用于悬浮细胞分批培养、微载体和连续培养。19工作原理反应器运转时，圆筒以30-60r/min的速度转动，由于离心力的作用，搅拌器中心管内产生负压，使搅拌器外培养基流入中心管，沿管螺旋上升，再从导流筒口排出，从搅拌器外沿下降，形成循环流动。在气腔内气体由分布管鼓泡，气体溶于液体中，依靠气腔丝网外液体的循环流动及扩散作用，使溶于液体中的气体成分均匀地分布到反应器内。20Celltech公司采用气升式反应器培养杂交瘤细胞，生产单克隆抗体。生产周期为14~400h。从10L逐级放大到10000L。17d生产抗体100g，抗体合成大多数处于稳定期和衰退期，比传统摇瓶提高约5倍。21通气搅拌式细胞培养反应器222324旋转式细胞培养系统20世纪90年代中期，美国宇航局开发一系列旋转式细胞培养系统(Therotarycellculturesystem,RCCS)，又叫回转式生物反应器(Rotatingwallvesselbiore-actor,RWVB)。RCCS是绕水平轴旋转、无气泡、膜扩散式气体交换的培养系统。25该反应器是将细胞种植到微载体后，将其移入RCCS圆柱状的培养容器内，加满培养液。整个容器由电机驱动沿水平轴旋转，细胞微载体颗粒在水平轴内建立均质的液体悬浮轨道，并随容器一起旋转且不与容器壁和其它物体相撞。细胞通过膜式气体交换器来吸氧和排出CO2。由于系统无推进器、气泡或搅拌器,使破坏性应力减到最小。因此，细胞可以在相对温和的环境中进行三维生长，得到类似人体内的培养产物.近年来已经广泛应用于微载体系统，至今已有近百种组织细胞均在该系统内成功进行了大规模扩增。2627悬浮培养与微生物的肉汤培养基本相同。悬浮培养细胞增殖快、产量高，没有接触抑制特性，是动物大规模培养的理想方法。但只有极少数动物细胞适宜进行悬浮培养，适用于确立细胞株（系）、杂交瘤细胞、肿瘤细胞、血液和淋巴细胞培养。28微载体培养微载体为三维培养系统，细胞贴附于微载体上伸展和增殖，微载体悬浮于培养液中。微载体培养具贴壁和悬浮培养的双重优点，有很大的比表面积，供单层细胞贴附和增殖。悬浮微球使细胞生长的环境均一，培养基利用率高，重复性好，容易放大。20世纪80年代正式用于工业化生产干扰素、疫苗和尿激酶原等。29理想的微载体所具备的性能：质地柔软，微球间摩擦轻；耐高温，可高压灭菌；透明性，便于观察细胞生长；细胞相容性，利于贴附和生长；无毒性和惰性，对细胞无毒害，不产生有害物质，不吸附培养基；低速即悬浮，静止即沉降，便于换液和收获；微粒大小均匀；可回收重复使用。30为了提高贴壁能力，对基质表面进行包埋，如血清蛋白、多聚赖氨酸处理，可加速贴壁过程。悬浮培养早期，还可向培养液补充丙酮酸、腺嘌呤、次黄嘌呤、胸腺嘧啶等。将这些微载体悬浮在培养液中，大大增加细胞的贴壁面积，可使每毫升培养基达到1000万个（108）细胞的密度。31常用微载体玻璃珠：直径约2～3μm，密度1.5g/cm3。在玻璃表面覆盖塑料或中空玻璃也可达到此密度。葡聚糖微载体：带正电，干粉在pH7.2的磷酸盐缓冲液中吸胀，清洗灭菌后使用。Cytodex2：电荷性大大下降，吸附能力很低，适合于蛋白质药物的生产。纤维素微载体DE52和DE53：适合多种细胞培养。聚丙烯酰胺载体：贴壁较快，亲水性。32多孔微载体：直径0.2～5mm，孔径20～300μm，达占总体积的85%，极大地增加了比表面积，可实现细胞的固定化，达到高密度培养。广泛使用的有：Cellsnow、Cytocell（纤维素基质）、Verax、Cultisphere（胶原）、Cytoline1和2（聚苯乙烯）、ImmobaSil（硅橡胶）及Siran（玻璃）等。主要用于搅拌、固定床和流化床反应器。3334微囊化培养利用固定化细胞技术，将一定量细胞与约4％的褐藻酸钠混合后，滴到CaCl2溶液中，构成半透性微胶囊。又称固定化细胞、大载体培养法。351）细胞在微胶囊内生长，既吸收外界营养，又可排出自身代谢物。2）细胞所受的剪切力损伤小，细胞生长良好，纯度提高。便于连续培养，提高培养细胞的利用率；3）细胞培养密度高，生长缓慢，有利于次生代谢产物的积累，提高产量。364）次生代谢物直接分泌到培养液中，可简化分离、收获步骤，提高工作效率。如次生代谢物不分泌，培养结束后，收获微囊，破微囊，纯化抗体。5）固定化细胞的氧气、营养供应与传递及细胞的遗传稳定性等问题有待于进一步研究解决。这种培养方法是生产单克隆抗体、干扰素的一种有效培养方法。目前，美国药用产品大规模生产常用此法进行。373839中空纤维（微导管）培养是模拟体内细胞三维生长环境而发明的。将由硝酸纤维素或醋酸纤维素构成外径不超过1mm（φ≤1mm）的微导管平铺成层，相当于体内的毛细血管。微导管表面贴壁生长细胞，管内通无菌空气，管外浸泡在培养液中，气体、水分及其它营养物质可以通过微导管与细胞进行交换。微导管表面的细胞密度可达100万/cm2个。细胞密度可达108/mL。40接种孔水套层产物出口培养基入口产物出口培养基入口内膜外膜腔室细胞培养基分散后,灌入床层。纤维管壁薄，半透膜，截留不同分子量。纤维管的空腔组成的内室：灌流含氧气的培养基纤维管之间的空间组成的外室：细胞生长。41细胞分泌的产物和血清中的成分由于分子量较大而无法进入内室，产物只能在外室积累和浓缩。细胞代谢的废物是小分子物质，可渗透进入内室，从内腔开口排出，避免了对细胞的毒性。在收获时，打开纤维管之间的外室开口，产物就流出来。此时虽然细胞停止分裂，但细胞的存活、健康和核形态不变，代谢和分化功能仍可保持数月。42第二节动物细胞生物制药用动物细胞的培养技术来生产有功能的蛋白质，特别是人源细胞的培养，在药物生产中的位置越来越重要。一、表达蛋白的宿主系统二、生产用动物细胞的要求三、常用动物细胞的特性四、基因工程细胞构建和筛选五、细胞库的建立43常见的动物细胞培养产物疫苗小儿麻痹症疫苗、狂犬疫苗、脑炎疫苗、疱疹疫苗、风疹疫苗单克隆抗体IgG、IgM、IgA等免疫调节剂细胞生长因子、干扰素、白细胞活化因子、胸腺肽酶胰蛋白酶、尿激酶、胶原酶、胃蛋白酶激素生长激素、促红细胞生成素44基因工程药物生产示意图45一、表达目的蛋白的宿主系统总体分为：原核表达系统和真核表达系统。常见的宿主系统细菌、酵母、霉菌、丝状真菌、植物细胞、哺乳动物细胞等。46原核表达系统----细菌特点：繁殖快、易于培养，限制：表达的蛋白质缺乏转录后的修饰；原核系统表达的蛋白一般为胞内产物，需要破碎细胞提取产物，给产物的分离纯化带来困难；还易受外源毒素的污染。47真核表达系统特点表达后的蛋白有修饰作用，与人体自身分泌的天然蛋白非常近似；动物细胞表达的蛋白都是胞外分泌，产物的分离纯化过程非常简单。但是，动物细胞大规模培养比较复杂，目前仍处于发展完善阶段。48表达系统的选择原核表达系统：一般“小分子、结构简单”的蛋白生产，且蛋白转录后无需修饰，如胰岛素；真核表达系统：主要“生产大分子、结构复杂的蛋白”，并且转录后的修饰对蛋白的生物活性具有重要影响，如组织型纤溶酶原激活剂(tPA）、促红细胞生成素等（EPO）等。对既可用原核、可用真核表达的蛋白如α-干扰素、人生长激素等，应综合考察生产的经济成本和技术难易程度等选择表达系统。49口蹄疫疫苗生产示意图50过去使用动物生产的生物制品，经常发生过敏反应或病原体传染事件。如脊髓灰质炎疫苗可能被猿猴肾病毒污染；用人血制备的某些生物制品可能被肝炎或艾滋病病毒污染。采用细胞工程生产的产品能将致病因素降到最小：动物细胞培养所用的细胞背景明确，经过严格的安全检测，消除了污染病原体的危险。51实例EPO的生产：以前需要从2500L再生障碍性贫血病人的尿液中才能提取极微量的EPO用于实验室分析。现在，通过大规模培养基因工程细胞生产的EPO，已经治疗了成千上万的肾性贫血的病人。胰岛素的生产：过去从猪胰腺中提取胰岛素，但某些患者会引起抗原抗体反应。基因工程可以用人胰岛素基因生产人源化蛋白，克服免疫反应的缺点。52动物细胞表达系统的不足细胞生长缓慢，生产效率较低，产量远远落后于其他表达系统。如骨髓细胞MPG-11生产IgG，每个细胞1分钟为5pg，10L反应器，细胞密度为107/mL，生产能力不到1g/d。连续细胞系增加了生长和代谢速率，但同时导致了副产物的增加。53动物细胞对培养条件要求苛刻和敏感，对温度、pH、渗透压、剪切力等忍受能力差。需要添加氨基酸、维生素、血清、生长因子等，培养基要求高，生产费用较高。54原代细胞二倍体细胞系转化细胞系二、生产用动物细胞的要求55⒈原代细胞直接取