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项目名称：重要病原菌与宿主相互作用分子机制的研究首席科学家：戈宝学同济大学起止年限：2012.1-2016.8依托部门：教育部上海市科委一、关键科学问题及研究内容本项目将紧密围绕细菌性传染病防控和国家安全（生物反恐）等国家重大需求，以重要胞内病原菌土拉杆菌，结核杆菌和鼠疫菌为模型，系统地研究病原菌和宿主之间相互作用的分子机制，拟重点研究解决以下关键科学问题：1.胞内病原菌侵入宿主细胞的分子调控机制？2.胞内病原菌在宿主细胞内存活的分子调控机制？3.胞内病原菌因子如何干扰宿主细胞的关键信号通路？主要研究内容为了解决以上三个关键科学问题，本项目拟以重要胞内病原菌土拉杆菌，结核杆菌和鼠疫菌为研究对象，系统地筛选发现鉴定与病原菌侵入及胞内存活相关的病原菌致病因子和宿主因子，研究病原菌和宿主的功能非编码RNA和蛋白质的相互作用，病原蛋白-宿主蛋白之间的相互作用，及泛素及类泛素化蛋白修饰等如何调控病原菌进入宿主细胞并在胞内存活及相关信号通路的分子机制，具体为以下六方面的研究：1.发现和研究与病原菌侵入及胞内存活相关的宿主细胞因子及分子调控机制：1）研究一些宿主关键免疫分子对病原菌侵入及胞内存活的调控的分子机制；2）筛选与病原菌侵入或存活相关的新的宿主细胞因子并研究其功能机制。2.发现和研究与病原菌侵入及胞内存活相关的病原菌因子及分子调控机制：1）利用转座子技术筛选和研究与病原菌侵入或存活相关的病原菌致病因子；2）利用过表达病原菌分泌蛋白组筛选与研究与胞内存活相关的致病因子。3.研究非编码RNA-蛋白相互作用调控病原菌侵入及胞内存活的分子机制：1）大规模发现病原菌和宿主新的非编码RNA；2）构建非编码RNA-蛋白相互作用网络；3）研究非编码RNA-蛋白相互作用调控病原菌侵入及胞内存活的分子机制4.研究病原-宿主蛋白相互作用调控病原菌侵入及胞内存活的分子机制：1）筛选和文献挖掘病原菌-宿主相互作用蛋白；2）构建和分析病原菌-宿主蛋白相互作用网络；3）进行病原和宿主相互作用蛋白的结构免疫学研究；4）研究重要的病原菌和宿主相互作用蛋白调控病原菌侵入及胞内存活的分子机制5.研究泛素化或类泛素化蛋白等修饰调控病原菌侵入及胞内存活的分子机制；1）研究一类具有重要免疫调控功能的宿主泛素系统中的关键分子在病原菌侵入及胞内存活过程中的调控作用及其分子机制；2）探寻与胞内菌在宿主巨噬细胞中的存活相关的新的泛素连接酶，并研究其免疫调控功能和分子机制；3）发现与宿主泛素及类泛素化系统相关分子相互作用的病原菌蛋白分子，并研究其调控病原菌侵入及胞内存活的分子机制；4）研究胞内菌中含pupylation修饰的蛋白酶体底物蛋白分子与宿主的泛素及类泛素系统相关分子间的相互作用及其调控病原菌侵入及胞内存活的分子机制；；5）泛素及类泛素系统关键分子及其相互作用蛋白的结构免疫学研究6.研究胞内病原菌干扰宿主免疫细胞的功能及分子机制：1）检测临床结核杆菌感染病人肺巨噬细胞功能的变化及对信号通路的影响；2）研究重要差异分子对巨噬细胞功能的影响及调控病原菌侵入及胞内存活的分子机制；3）检测临床结核菌感染病人CD4+T细胞功能的分化及对信号通路的影响；4）研究重要差异分子对CD4+T细胞功能的影响及通过CD4+T调控病原菌侵入巨噬细胞及胞内存活的分子机制；二、预期目标总体目标以重要胞内病原菌土拉杆菌，结核杆菌和鼠疫菌为模型，阐明胞内病原菌侵入宿主细胞的分子调控机制；阐明胞内病原菌在宿主细胞内存活的分子调控机制；阐明胞内病原菌因子如何与宿主因子相互作用干扰宿主免疫信号通路的分子机制；发现诊断与治疗病原菌的新靶点，为控制病原菌感染和提高病原菌感染相关疾病的治愈率奠定基础。同时在病原菌-宿主相互作用的研究领域为我国培养一批优秀人才。五年预期目标1.发现和确定一些新的调控病原菌侵入宿主细胞的分子机制；2.发现和确定一些新的调控病原菌在宿主细胞内存活的分子机制;3.发现和确定一些病原菌和宿主相互作用中的新的关键信号转导分子；4.通过培养硕士、博士研究生和博士后，扶植一批在病原菌-宿主相互作用研究领域具有国际竞争力的优秀中青年科学家，造就一支结构合理的具备攻坚能力的国际先进水平研究队伍。5.以研究论文和独立开发的技术成果（专利）的形式公布项目研究成果，五年内SCI论文50篇左右，其中影响因子大于5的学术论文30篇左右，争取在国际高水平刊物（影响因子大于10）上发表论文4-6篇,在国际顶尖杂志Cell,Nature或Science上发表论文，并申报专利3-5项。三、研究方案学术思路病原菌的感染性和致病力是病原菌-宿主免疫系统间相互作用的结果。而胞内病原菌侵入宿主细胞，胞内存活及干扰宿主的免疫信号通路的调控机制极其复杂，提示病原细菌必然通过大量与宿主因子的相互作用来干扰免疫细胞的信号通路，从而侵入细胞并抑制宿主细胞吞噬溶酶体途径、炎症小体的形成、自噬、炎症等过程来实现其在胞内存活。本项目针对国家战略需求，瞄准国际科学前沿和本领域中的关键科学问题，通过发挥我们已有研究工作基础以及各课题组研究队伍的技术特点和优势，在基因水平、蛋白质水平、细胞水平和整体水平上，综合应用分子生物学、分子遗传学、细胞生物学、生物化学、结构免疫学、以及系统生物学等多学科交叉手段，以重要胞内病原菌土拉杆菌，结核杆菌和鼠疫菌为研究对象，系统地筛选鉴定与病原菌侵入细胞，胞内存活相关的病原菌致病因子和宿主因子，并在分子水平上研究病原菌和宿主的功能非编码RNA和蛋白质的相互作用，病原-宿主之间的蛋白的相互作用，及泛素及类泛素化蛋白修饰等如何调控宿主细胞的免疫信号通路从而影响免疫细胞的功能以调控病原菌进入宿主细胞并在胞内存活，及在感染动物水平和临床感染水平上研究这些病原菌因子与宿主因子的相互作用对病原菌的感染性和致病力的调控作用的分子机制（图一），这些研究将不仅能发现其胞内病原菌与宿主互作中的新的作用机制；而且能为诊断和防治传染性病原菌疾病提供新的药物靶点和重要的理论基础。技术途径及创新性技术途径本项目在总体目标的架构下分为六个主要的课题方向（见课题设置），各课题方向的主要技术途径总结如下：课题一：1）研究分析一些宿主关键免疫分子对胞内病原菌感染的调控的分子机制利用宿主细胞的一些模式识别受体如TLR2,TLR4,TLR7,TLR9，CARD9,NOD2,NLP3等，及宿主免疫系统中的一些关键受体信号转导分子如SHP-1,SHP-2,IL-17,MKP-5,β-arrestin1,β-arrestin2等基因敲除小鼠分离巨噬细胞来图一：重要病原菌与宿主相互作用分子机制的研究示意图感染土拉杆菌，结核杆菌或鼠疫菌以检测分析其对病原菌侵入及存活信号通路机制的影响；进一步利用基因敲除小鼠感染模型来检测分析其感染病原菌后的存活，细胞因子和免疫细胞亚群数量的变化及功能；选择调控胞内菌致病性的关键受体或分子进一步以细胞转染模型，RNA干扰，抗体封闭，Westernblot，酵母双杂交等手段来检测这些宿主分子如何调控胞内菌侵入和存活的免疫信号通路机制；2）基因组RNAi技术筛选和分析与胞内菌侵入或存活相关的宿主细胞因子用转入GFP或报告基因质粒的胞内菌如土拉杆菌或鼠疫菌感染经过基因组NAi转染的巨噬细胞，然后在30分钟或6小时后通过荧光扫描，报告基因分析或细菌培养和计数分析侵入巨噬细胞中的胞内菌及在巨噬细胞中存活的胞内菌数量；对筛选到的候选基因通过新一轮的RNAi和胞内菌感染实验进行确定；选择3-6个巨噬细胞表面细胞受体或关键信号转导分子进行重点研究；通过RNAi或基因敲除后研究其胞内菌在侵入和胞内存活的作用机制；用基因敲除小鼠感染模型研究其在土拉杆菌或鼠疫菌感染致病过程的作用机制。课题二:1）筛选和分析与土拉杆菌侵入或存活相关的病原菌致病因子以土拉杆菌为模型，采用转座子插入突变方法，构建该菌的随机突变文库。将土拉杆菌突变株文库中突变株分别感染体外培养巨噬细胞，通过细菌培养和计数筛选出有侵入/存活缺陷突变株；选择与细菌侵入/存活有关的细菌外膜蛋白和主要表面结构成分进行重点研究，利用大肠杆菌表达和纯化蛋白制备特异性抗体，采用免疫共沉淀分离宿主细胞膜上相应的受体蛋白电泳分析纯化后进行质谱分析；采用RNA干扰技术、细胞转染技术及共聚焦显微分析技术确定受体表达对细菌感染的影响。进一步通过基因mRNA检测、免疫组化染色等确定受体分子在小鼠组织和细胞中的分布；通过检测受体相关细胞信号传递和细胞反应，阐明细菌源配体在土拉杆菌感染治病过程中的作用机制；选择主要的细菌黏附蛋白，结合生物信息分析和预测，合成或表达不同长短的多肽片段确定配体分子中与受体结合的关键区域。2）土拉杆菌致病相关基因的筛选与研究在巨噬细胞感染模型中，采用包括生物信息学、转录组学，蛋白组学和胞内差异荧光筛选等手段，在土拉杆菌基因组范围内，高通量地分析菌体分泌蛋白在宿主细胞中的诱导表达。针对在宿主细胞内特异表达的靶蛋白，将对其编码基因采用敲除、互补等遗传分析方法，构建相应的基因工程菌株，并结合质粒转染表达以及Microarray等技术，在相关的细胞模型和动物模型中，进一步鉴定和确认靶蛋白与土拉杆菌的胞内生存是否相关；通过细胞转染技术，在宿主细胞模型中表达土拉杆菌致病相关蛋白。利用RT²Profiler™PCRArrays技术，研究病原菌致病相关蛋白对宿主细胞不同信号传导途径的影响，包括细胞因子与炎症反应（cytokineandinflammation）、自体吞噬、SHIP、NFB以及PI3K－AKT信号传导等途径。同时采用ELISA、multiplexFACS、ELISPOT以及WesternBlot等手段，验证PCRArrays的分析结果。结合崭新的反转录病毒介导的蛋白互补方法”与酵母双杂交系统，在基因组范围内，筛选与土拉杆菌重要致病相关蛋白作用的宿主细胞蛋白。进一步用蛋白质标记、免疫沉淀以及相关蛋白质组学等方法，验证土拉杆菌蛋白与宿主细胞蛋白间的特异结合反应，并采用RNA干扰和抗体干扰等技术，阐明宿主细胞蛋白在土拉杆菌感染中的应答及信号路调控机制；利用荧光标记、免疫组化以及细胞实时成像（RealtimeImaging）等技术，研究土拉杆菌在胞内所分泌蛋白的定向运输和分布定位，从“时空”角度分析土拉杆菌致病蛋白与宿主细胞相关蛋白的相互作用，从而了解在宿主细胞内生存的机制。课题三：1）大规模地发现与结核病相关的病原菌（结核菌）和宿主（小鼠）新的非编码RNA以结杆核菌为模型，用结杆核菌标准株H37Rv感染小鼠，分别提取宿主不同组织（肺，淋巴，脾，肝）总RNA，进行RNA-Seq测序分析非编码RNA的差异表达分析和定量蛋白质组学分析蛋白质的差异表达；从生物体内特异提取非编码RNA,并利用纯化的ncRNA建立非编码RNA的文库；通过高通量、快速的短串RNA测序技术对文库进行测序,发现候选的新的非编码RNA。经过Northern验证和生物信息分析确认该病原和病原感染后病原与宿主差异表达的非编码RNA的信息。2）从实验和理论两方面同时研究非编码RNA在病原与宿主互作中的分子机制运用系统生物学和生物信息学的方法如：靶分子预测方法等或分子垂钓方法来寻找与这些差异表达的非编码RNA分子可能发生相互作用的病原或宿主的蛋白质；在分子水平上研究RNA和蛋白质的相互作用；在细胞水平上，用敲除、过量表达和干扰的方法研究非编码RNA对相关基因表达的调控功能；在整体动物水平上，构建缺陷或过量表达非编码RNA的菌株感染小鼠比较致病性等情况来研究非编码RNA的功能。3）构建有非编码RNA-蛋白相互作用网络并研究其在结核杆菌感染过程中的调控作用根据前两步的试验结果，将存在相互作用的非编码RNA和蛋白质组成一类新的网络。然后使用传统的或我们建立的复杂网络分析方法提取其数学、物理特征，进而研究其生物学含义。课题四：1）筛选和文献挖掘病原菌-宿主相互作用蛋白以鼠疫菌为模型，挑选100-200个鼠疫菌毒力相关蛋白构建诱饵载体，采用高通量酵母双杂交技术平台筛选与鼠疫菌蛋白相互作用的宿主蛋白；对鼠疫菌蛋白与宿主蛋白相互作用进行其它技术的验证