细胞生物学实验指导

细胞生物学实验指导主编朱卫平湖南农业大学植物科学实验教学中心二○○六年七月1目录实验一细胞形态、大小与显微结构观察………………………1实验二细胞膜的渗透性………………………………………5实验三叶绿体的分离与荧光观察……………………………7实验四线粒体和液泡系的超活染色与观察………………11实验五细胞凝集反应………………………………………17实验六DNA的Feulgen染色法………………………………19实验七PAS反应法显示多糖…………………………………22实验八植物细胞骨架的光学显微镜观察…………………24实验九植物染色体标本的制备与观察……………………26实验十细胞电融合方法…………………………………29综合大实验……………………………………………………39一石蜡切片法………………………………………………39二半自动显微镜摄影技术…………………………………41三全自动显微照相技术……………………………………44四暗室技术—印相与放大…………………………………471实验一细胞形态、大小与显微结构观察一、实验目的1、观察各种不同细胞的形态大小，从而对细胞的分类，进化及分化有所了解。2、判断和识别光学显微镜下各种细胞器的形态，大小和数目。3、掌握普通光学显微镜及测微尺的使用方法。二、实验原理生物种类繁多，形态大小各异．构成生物有机体的最基本结构和功能单位—一细胞山冈其物种、部位和功能不同在形态与大小上呈现一些区别。由于细胞比较小，我们借助于显微镜就可以观测出细胞形态大小的差异。光学显微镜的最高分辨率为0.2μm，而细胞器大郎分在0.1μm和10μm之间，所以光学显微镜下可见到一股细胞器的外部形态。较大的细胞器和细胞核，质体等还可见到其细微结构。细胞器往往由特殊物质组成，因而可通过对特异物质的区别染色把各种结构区分开束，每种细胞器都有特殊的形态、大小、分布位置及数目，这也是我们判断。识别细咆器的依据。而每种细胞器在不同细胞、不同发育时期和不同生理状态下的形态大小会有所不同。所以细胞器的观察可用来判断细胞的生理状和发育情况。投们在取材和观察上要注意各种细胞在不同细胞中的特殊性。三、实验用品1、器材显微镜、测微尺22、试剂Wright溶液：Wright真粉剂0.1g甲醇60ml苏木精、硝酸银等3、材料真核、原核细胞涂片及切片，动、植物不同组织的切片及新鲜材料（见实验方法中所列)。四、实验方法(一)细胞形态与大小的观测1、用目镜测微尺分别在高倍镜下和油镜下测量镜台测微尺，从而算出称所用显微镜中目镜测微尺每格所代表的实际长度。2、用高倍镜及油镜检测各种切片，并且用目镜测微尺测量细胞和细胞核的长、短径的长度。3．选取细胞膜和核膜界限清晰的切片或涂片测量。测量时可旋转目镜（测微尺)及移动载玻片，置被测细胞于测微尺轴线上。4．根据测量结果计算各种细胞及细胞核的体积。①椭球形：V=4nab2/3式中：a——长半径b——短半径②圆球球：V=34πr2式中r——半径③V=πr2h式中：r——半径3h——高度表1-1实验结果细胞名称形态特征细胞体积核体积核质比例酵母大肠杆菌洋葱表皮细胞蛙血细胞（二）细胞显微结构观察注意观察下列结构1、细胞核及核仁①不同细胞的核和核仁洋葱根尖切片黄花菜二倍体与四倍体根切片（示范）②多核及多核仁现象百合花药切片黄花菜四倍体根尖切处③染色体：洋葱根尖切片小麦根尖压片（示范）荻根尖压片（示范）2、线粒体：洋葱根尖切片，蚕豆根尖切片（Rubins或苏木精染色）3、叶绿体：水绵新鲜材料临时装片。由波菜叶片剥下叶肉细胞层，镜检，注意类囊体形态、数目。4、高尔基体：蚕豆根尖切片（硝酸银或四氧化锇染色）4作业：1、说明有细胞分化过程中细胞大小相对稳定的原因。2、绘制细胞显微结构图，把你所见到的各种细胞器绘制在一个细胞内。注意细胞器外形特点，大小，分布位置，数目。3、查资料回答问题：某些细胞多核及多核仁的原因。5实验二细胞膜的渗透性实验目的了解细胞膜的渗透性及各类物质进入细胞的速度。实验原理将经细胞放入数种等渗溶液中，由于红细胞对各种溶质的透性不同，有的溶质可以渗入，有的溶质不能渗入，渗入的溶质能够提高红细胞的渗透压，所以促使水分进入细胞，引起溶血。由于溶质透入速度互不相同，因此溶血时间也不相同。实验用品一、器材50ml小烧杯，10ml移液管,试管（1—10cm），度管架。二、试剂0.17mol/L氯化钠、0.17mol/L氯化铵、0.17mol/L醋酸胺、0.17mol/L硝酸钠、0.12mol/L草酸铵、0.12mol/L硫酸钠、0.32mol/L葡萄糖、0.32mol/L甘油、0.32mol/L乙醇、0.32mol/L丙酮。三、材料羊血实验方法一、羊血细胞悬液取50ml小烧杯一只，加1份羊血和10份0.17mol/L氯化钠溶液，形成一种不透明的红色液体，此即稀释的羊血。二、低渗溶液取试管一支，加入10ml蒸馏水，再加入1ml稀释的羊血，注意观察溶液颜色的变化，由不透明的红色逐渐澄清，说明红细胞6发生破裂造成100%红细胞溶血，使光线比较容易透过溶液。三、羊红细胞的渗透性1、取试管一支，加入0.17mol/L氯化钠溶液10ml，再加入1ml衡释的羊血，轻轻摇动，注意颜色有无变化？有无溶血现象？为什么？2、取试管一支，加入0.17mol/L氯化钠溶液10ml，再加入1ml稀释的羊血，轻轻摇动，注意颜色有无变化？有无溶血现象？若发生溶血，记下时间（自加入稀释羊血到溶液变成红色透明澄清所需时间）。3、分别在另外8种等渗溶液中进行同样实验。步骤同2。实验结果将观察到现象列入下表，对实验结构进行比较和分析。不同低渗溶液下的溶血现象试管编号是否溶血时间结果分析1.10氯化钠+1ml稀释羊血2.10氯化钠+1ml稀释羊血3.10ml醋酸铵+1ml稀释羊血4.10ml硝酸钠+1ml稀释羊血5.10ml草酸铵+1ml稀释羊血6.10ml硫酸钠+1ml稀释羊血7.10ml葡萄糖+1ml稀释羊血8.10ml甘油+1ml稀释羊血9.10ml乙醇+1ml稀释羊血10.10ml丙酮+1ml稀释羊血7实验三叶绿体的分离与荧光观察叶绿体足植物细胞所特有的能量转换细胞器，光合作川就是在叶绿体中进行的。由于具有这一重要功能，所以它一直是细胞生物学、遗传学和分子生物学的重要研究对象。叶绿体是植物细胞中较大的一种细胞器，利用低速离心即可分离集中进行各种研究。实验目的一、通过植物细胞叶绿体的分离。了解细胞器分离的一般原理和方法。二．观察叶绿体的自发荧光和次生荧光．井熟悉荧光显微镜的使用方法。实验原理将组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差迷离心，是分离细胞器的常用方法，一个颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗粒的大小、形状和密度，也同离心力以及悬浮介质的粘度有关。在一给定的离心场中，同一时间内，密度和大小不同的颗粒其沉降速度不同。依次增加离心力和离心时间，就能够使非均一悬浮中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部．分批收集即可获得各种亚细胞组分。叶绿体的分离应在等渗溶液(0.35mol/L氯化钠或0.4moJ/L蔗糖溶液)中进行，以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤。将匀浆液在1000r/min的条件下离心2min，以去除其中的组织残渣和一些未被破碎的完整细胞。然后，在3000r/min的条件下离心5mia，即可获得沉淀的叶绿体(混有部分细胞核)。分离过程最好在0—5℃的条件下进行：如果在室温下，要迅速分离和观察。荧光显微术是利用荧光显微镜对可发荧光的物质进行观察的8一种技术。某些物质在—定短波长的光(如紫外光)的照射下吸收光能进入激发态，从激发态回到基态时，就能在极短的时间内放射出比照射光波长更长的光(如可见光)，这种光就称为荣光．若停止供能荧光现象立即停止。有些生物体内的物质受激发光照射后直接发出荧光，称为自发荧光(或直接荧光)，如叶绿索的火红色荧光和水质素的黄色荧光等。有的生物材料本身不发荧光，但它吸收荧光染料后同样也能发出荧光，这种荧光称为次生荧光(或间接荧光)，如叶绿体吸附吖啶橙后可发桔红色荧光。利用荧光显微镜对可发荧光物质进行检测时，将受到许多因素的影响，如温度、光、淬灭剂等。因此在荧光观察时应抓紧时间，有必要时立即拍照。另外，在制作荧光显微标本时最好使用无荧光载玻片，益玻片和无荧光油。实验用品一、器材1、主要设备：普通离心机、组织捣碎机，粗天平、荧光显微镜。2、小型器材，500ml烧杯2个，250ml量筒1个，滴管10支，10ml刻度离心管20支，纱布若干，无荧光载片和盖片各4片。二、材料新鲜菠菜。三、试剂0.35mol/L氯化钠溶O.01%吖啶橙(acridineorange)。实验方法1、选取新鲜的嫩菠菜叶，洗净擦干后去除叶梗及粗脉，称30g于150ml0.35mol/LNaCI溶液中，装入组织捣碎机。2、利用组织捣碎机低速（5000r/min）匀浆3—5min。93、将匀浆用6层纱布过滤于500ml烧杯中。4、取滤液4ml在1000r/min下离心2min。弃去沉淀。5、将上沾液在3000r/min下离心5rmin．弃去上清液，沉淀即为叶绿体(混有部分细胞陔)。6、将沉淀用0.35mol/LNaCI溶液悬浮。7、取叶绿体悬液一消滴于载片上，加盖片后即可在普通光镜和荧光显微镜下观察。①在普通光镜下观察。②在荧光显微镜下观察。③取叶绿体悬液一滴滴在无荧光载片上，再漓加一滴0.01%吖啶橙荧光染料，加无荧光盖片后即可以荧光显微镜下观察。二、菠菜叶手切片观察用剖须刀将新鲜的嫩菠菜切削一斜面置于载片上，滴加1--2滴0.35mol/LNaCI溶液，加盖片后轻压，置显微镜下观察。①在普通光镜下观察。②在荧光显微镜下观察。③用同样方法制片，但滴加I--2滴0.01%吖啶橙染液染色lmin，洗去余液，加盖廾后即町以荧光显微镜下观察。实验结果一、叶绿体的分离和观察1、普通光镜下，可看到叶绿体为绿色橄榄形，在高倍镜下可看到叶绿体内部含有较深的绿色小颗粒，即基粒。2、以Olympus荧光显微镜为例，在选用B(blue)激发滤片，B双色镜和O530(orange)阻断滤片的条件下，叶绿体发出火红色荧光。3、加入吖啶橙染色后，叶绿体可发出桔红色荧光，而其中混有的细胞核则发绿色荧色。10二、菠菜叶手切片观察1、在普通光镜下可以看到三种细胞(1)表面细胞：为边缘呈锯齿形的鳞片状细胞。(2)保卫细胞：为构成气孔的成对存在的肾形细胞。(3)叶肉细胞：为排成栅状的长方形和椭幽形细胞。叶绿体呈绿色橄榄形，在高倍镜下还可以看到绿色的基粒。2、在荧光显微镜下，叶绿体发出火红色荧光，但其荧光强度要比游离叶绿体弱。气孔发绿色荧光，两保卫细胞内的火红色叶绿体则环绕气孔排列成一圈。表皮细胞内叶绿体数量要比叶肉细胞少。3、用吖啶橙染色后，叶绿体则发出枯红色荧光，细胞核町发出绿色荧光，气孔仍为绿色。作业1、在普通光镜下，用目镱测微尺和台镜测微尺测量一下叶绿体的长轴和短轴，分别测重5—10个叶绿体，求其平均值。2、在荧光显微镜下观察叶绿体的自发荧光时，更换滤片系统，叶绿体的颜色是否有变化?3、游离叶绿体和整体细胞内的叶绿体，在荧光显微镜下，具颜色和强度合无差异？思考题1、叶绿体分离的实验原理是什么?在分离叶绿体时应注意些什么问题?2、普通光镜与荧光显微镜有何异同点?11实验四线粒体和液泡系的超活染色与观察实验目的一、观察动、植物活细胞内线粒体，液泡系的形态、数量与分布。二、学习一些细胞器的超活染色技术。实验原理活体染色是指对生活有机体的细胞或组织能着色但又无害毒的一种染色方法。它的目的是显示生活细胞内的某些结构。而不影响细胞的生命活动和产生任何物理、化学变化以致引起细胞的死亡。活染技术可用来研究生活状态下的细胞形态结构和生理．病理状态。根据所用染色剂的性质和染色方法的不同，通过把活体染色分为体内活染与体外活染两类。体内活染是以胶体状的染料溶液注入动。植物体内，染料的胶粒固定、堆积在细胞内某些特殊结构里，达到易于识别的目的。体外活染又称超活染色，它是由活的动、植物分离出部分细胞或组织小块，以染料溶液浸染，