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目录实验一细胞的形态结构与显微测量……………………………………1实验二DNA和RNA的显示………………………………………………6实验三细胞内酸性蛋白和碱性蛋白的显示……………………………7实验四细胞内酸性磷酸酶的显示………………………………………9实验五线粒体和高尔基复合体的光镜观察……………………………11实验六细胞生理活动的观察……………………………………………13实验七有丝分裂标本的制备和观察……………………………………14实验八减数分裂标本的制备与观察……………………………………16实验九细胞组分的分级分离……………………………………………19实验十细胞培养技术……………………………………………………22实验十一细胞培养的冻存与复苏技术……………………………………38实验一细胞的形态结构与显微测量【实验目的】1.掌握人体及动物等真核细胞的基本形态结构。2.掌握临时玻片标本的制备方法。3.进一步掌握光学显微镜的使用方法。4.掌握显微测量的基本方法。【实验原理】细胞是生物体的结构和功能的基本单位。构成人体或其他高等生物体的细胞种类繁多、形态各异，而且这些细胞的形态与其功能往往相适应，如具有收缩功能的肌细胞呈条形或长梭形；运输O2和CO2的红细胞(RBC)为双凹圆盘状，便于在血管中流动；具有感受刺激、传导冲动功能的神经细胞一般附有长短不一的树枝状突起；精子细胞具有一根长长的鞭毛，故很善于运动；巨噬细胞（macrophage）呈不规则形状，能伸出伪足，吞噬和消灭外源的病原微生物。细胞的体积差别很大，一般来讲，真核细胞的体积要大于原核细胞，高等动物的卵细胞大于体细胞（卵细胞含有较多的营养物质──卵黄）。对于大多数人体及动物的细胞来说，其体积一般在20～30μm之间，必须借助于光学显微镜才能被观察到。由于细胞体积微小，而且含有较大比例的水，故大多是无色透明的，如果不经染色处理，在显微镜下难以看清细胞的结构。因此，要观察某种细胞时，通常先进行染色处理。在普通光镜下，一般可见人体及动物细胞的基本结构分为细胞膜、细胞质和细胞核等3个部分。细胞中分布有多种具有一定结构与功能的细胞器，它们有的体积较大，如线粒体和高尔基复合体，可通过不同的染色方法将其在光镜下分别显示出来，这些在光镜下常可见的结构通常称为细胞的显微结构。【器材与试剂】1.器具：显微镜、载玻片、盖玻片、蜡盘、牙签、纱布、药棉、吸水纸、擦镜纸、剪刀、小尖摄、解剖针、玻璃缸、显微测微尺。2.材料：小白鼠、青蛙、蟾蜍、人口腔上皮细胞、洋葱、鸡血液、人血液、小鼠精子、兔或猪脊髓、蛙肾小管切片、猫卵巢切片、猫小肠切片、兔或大鼠肝脏切片。3.试剂：1％碘液、1％甲苯胺蓝、瑞特染液，Ringer液，显微镜油，乙醚酒精，二甲苯。4.试剂的配制：⑴1％碘液：称取1g碘片和2g碘化钾溶于100ml的80％乙醇或蒸馏水中即可。⑵1％甲苯胺蓝：称取1g甲苯胺蓝染料加蒸馏水100ml溶解即可。⑶瑞特染液：称取0.1g瑞特染料（Wright'sstain）粉放入研钵中研细，从60ml甲醇中取少许加入研钵中反复研磨，昀后加入全部甲醇混匀，装入棕色瓶中保存备用。【内容与方法】一、细胞标本的制备及细胞基本形态结构的观察所有需观察的细胞都应放置到无色透明的载玻片上制备成临时或永久玻片标本后才适于在光镜下观察，在很多情况下，在细胞或组织上还需加盖一张薄而小的玻片──盖玻片，以起到保护标本的作用。制备玻片标本所用载玻片和盖坡片要进行清洁，其步骤如下：载玻片先用洗衣粉水刷洗，清水冲洗后，经洗液浸泡24小时以上，再用流水充分冲洗，昀后烤干备用。对于临时制片所用的载玻片和盖玻片若要求不高也可用揩擦的办法来清洁，即取一张载玻片，用左手拇指和食指夹持载玻片的两端，右手的拇指和食指夹着一块清洁而柔软的布或卫生纸巾，把载玻1片放在两手指夹着的布间，然后均匀地前后移动擦净载玻片的两面。盖玻片小而薄，擦时必须小心，把一张盖片放在左手两手指夹着的布间，并轻轻捏住，右手指夹持盖片的边缘向一个方向转动进行擦拭，用力需轻而均匀。（一）人口腔粘膜上皮细胞标本的制备与观察1.粘膜细胞涂片标本的制备：方法1:吸取一滴碘液滴在一张洁净的载玻片中央，用一根灭菌的牙签伸入自己的口腔内壁刮取粘膜上皮细胞，然后将它涂在载玻片上的染液中并来回搅动使细胞散开；方法2:刮取粘膜上皮细胞，按一定方向涂在洁净上的载玻电上，加一滴甲苯胺蓝溶液染色1分钟左右后小心加盖盖玻片（尽量避免产生气泡）用滤纸吸去盖玻片周围的液体。2.观察：将自制的口腔上皮细胞标本片置于显微镜下观察，先用低倍镜寻找较分散的、轮廓清晰的上皮细胞，由于该细胞体积较小、着色较淡，观察寻找时应稍降低视野中的亮度以便于较快找到目标。用甲苯胺蓝染色的上皮细胞呈淡蓝色，用碘液染色的呈黄色。成群或分散分布，形态大多呈扁平椭圆状（图2-1）。选择轮廓清晰的细胞移至视野中央，转高倍镜观察。高倍镜下可见人的口腔粘膜细胞外有一层薄薄的细胞膜，扁圆形的细胞核呈深黄色(碘染色)或深蓝色（甲苯胺蓝染色），位于细胞中央，细胞质染成浅黄色或浅蓝色。在核中有时可见一致密的结构，即为核仁。图2-1人口腔上皮细胞（二）血细胞涂片标本的制备与观察1.制片⑴用小吸管吸取已抗凝和稀释的人血、小鼠血或蟾蜍血滴一小滴至载玻片的右端，另取一张边缘光滑的载玻片，让其一边接触血滴，使之与玻片之间成30°～45°角，迅速向前推移，使玻片上留下薄而均匀的血膜（图2-2）。通常推片与玻片间的角度愈大，血膜愈厚；斜角愈小，速度愈快，则涂片愈薄。血滴的大小对血膜厚薄也有影响，血滴越大，则血膜越厚。推片时速度要一致，否则血膜呈波浪形，厚薄不匀。⑵将血涂片放置在空气中自然晾干，也可手持涂片在空气中晃动以加速其干燥。⑶染色：在玻片上血膜薄而均匀的区域滴上几滴瑞氏染液或先用玻璃蜡笔在血膜较薄区画一圆圈，再往圈中滴加染液，这样可防染液向四周扩散）。染色1分钟后往染液中加入等量的蒸馏水稀释染液，继续染2～3分钟。此时，液面上可浮现一层金黄色的金属样物质。⑷用自来水轻轻冲去玻片上的染液，晾干后即可。⑸以同样的方法再制备一张鸡血涂片。图2-2血涂片的制备方法22.观察：将已染好色的人血涂片标本（肉眼要可见血膜呈粉红色）放置到显微镜下，先用低倍镜检查整个血涂片，选择细胞均匀分布、较少重叠、有核细胞较多的区域，然后转换高倍镜仔细观察红细胞和白细胞（WBC）。在人或小鼠的血涂片上红细胞数目昀多、体积小、呈圆饼状，无细胞核（图2-3），胞质呈粉红色；白细胞在血细胞中所占比例较小，寻找较困难些，但胞体较大，细胞核明显，形态多样，呈蓝紫色。鸡或蟾蜍的血细胞的形态与人或小鼠等哺乳类有很大不同，在蟾蜍血涂片中，可见红细胞呈卵圆形，并具椭圆形的细胞核（图2-4）。图2-3人血红细胞形态图2-4蟾蜍血红细胞形态（三）动物脊髓神经细胞标本的制备与观察切取青蛙或蟾蛙脊髓一小段放到载玻片上，剪碎或捣碎，再取另一载玻片有力挤压脊髓使其成薄薄的一层，拿掉玻片后即得到神经组织的压片标本。然后滴加1～2滴甲苯胺蓝染液染色10分钟左右，昀后盖上盖玻片，吸去多余的溶液后即可进行观察。在显微镜下可见到许多被染成深蓝色的小细胞，它们是神经胶质细胞，而那些体积较大且具有多个星状突起的细胞即为脊髓前角运动神经细胞（2-5）。图2-5神经细胞的形态（四）小鼠或青蛙肝细胞压片标本制备与观察取小一块（2～3mm3）小鼠或青蛙的肝组织浸入Ringer液清洗并挤去所含血液，捞出后放置到载玻片上剪碎，盖上盖玻片或载玻片并用力挤压，取下盖玻片，滴加1％的甲苯胺蓝染液染色10分钟左右，昀后盖上盖玻片并用滤纸吸去多余染液，一张肝细胞压片标本就制备好了。将标本放到显微镜下，分别用低倍镜和高倍镜仔细观察肝组织压片，可见肝细胞呈紧密排列，被挤成了多角形，细胞核被染成深蓝色。（五）青蛙或蟾蜍骨骼肌细胞标本的制备与观察将一只青蛙或蟾蜍处死后，去除其腿部皮肤，剪下腿部肌肉一小块放至载玻片上，用尖镊或解剖针将肌肉剥离为肌束，再进一步将肌束剥成细长的肌纤维（直径小于头发丝），尽可能拉直肌纤维并用碘液染色1分钟左右，盖上盖玻片即可观察。在镜下可见，骨骼肌细胞为纤维状，有明暗相间的横纹，每个横纹肌细胞（肌纤维）具有多个细胞核，呈卵圆形，紧贴肌膜分布。(六）小鼠精子细胞的观察取一只小鼠的睾丸放入小烧杯或小瓶中彻底剪碎，加入37℃的生理盐水，用吸管吹打，使精子从精细管中游离出来，制成精子悬液。用吸管吸取悬液，滴一滴至载玻片上，盖上盖玻片，放到光镜下。由于精子很细小，且未经染色故观察时应将视野的亮度减小，视野中可3见每个精子细胞都具有细长的尾丝，可进行多种方式的运动。(七)显微测量（micrometry）1.显微测微尺及其使用方法显微测微尺（micrometer）简称测微尺，可用来在显微镜下测定标本大小。测微尺是由目镜测微尺（目尺）和镜台测微尺（台尺）所组成。目尺是块圆形玻璃片，玻片中央有一小的刻度尺，长5～10mm，分成50-100格（见图2-10）。每格的实际长度因不同的物镜的放大倍数和不同镜筒长度而有所不同。因此，用前必须用台尺进行标定后，才能代表真实长度。台尺是由一块载玻片制成，在某中央有圆形的测微尺，它的长度为1或2mm，分成100或200格，每格实际长度是0.01mm（10μm），（见图2-11）。图2-10显微测微尺目尺图2-11显微测微尺的台尺当用目尺测量细胞大小时，因为它的刻度没有具体长度，所以必须先用台尺核实每一格的长度，具体方法如下：⑴从显微镜上取下目镜，卸下目镜的上透镜，将目尺有刻度的一面向下轻轻地放在光圈板上，再旋上目镜的上透镜。⑵将台尺的刻度面向上，放在镜台上夹好，调节焦距，使台尺上的刻度清晰可见。⑶细心移动台尺和转动目尺，使两尺左边的一直线重合。然后由左向右找出两尺的另一重合的直线（2-12）。图2-12目尺测微尺（上）与台尺测微尺（下）⑷记下两重合线间目尺和台尺的格数，按下式计算出目尺每格等于多少μm:台尺的格数目尺每格的长（μm）=─────×10μm目尺的格数例如上图中台尺68格等于目尺的50格，将此代入上式可得出：68目尺每格长度＝──×10μm=13.6μm50分别在低倍镜和高倍镜下测定目尺每格等于多少μm。⑸取下台尺，换上你需要测量的标本，此时，用目尺就可直接测量欲测标本的大小（也就是测出目尺的格数），然后再将所得的格数乘以已测出的每格代表的长度，即可算出标本的实际大小。2.测量血细胞的大小按上述的测量步骤进行测量，每种细胞（红细胞、粒细胞和淋巴细胞）测量5个，求其平均值作为该细胞的大小，测量时，应选用几种放大倍数进行测量，以便比较。【作业与思考】1.绘图表示口腔上皮细胞的基本结构。2.细胞生物学绘图有哪些基本要求？3.如何制备血涂片标本？0123401234567844.分别求出使用低倍镜、高倍镜时目镜测微尺每格代表的长度。5.绘所观察的４种血细胞的基本结构。6.分别测量每种血细胞的直径５个，求其平均值（X），将测得的结果按下表方式记录在实验报告单上。人血细胞大小（直径）测量结果────────────────────────────────１２３４５平均数（X）─────────────────