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12345前言细胞生物学是高校生命科学的主干课程之一，是一门实验性很强的学科。生命科学的许多重大发现与细胞生物学实验技术的不断创新、发展是分不开的。因此，学习和掌握细胞生物学昀基本的技术和昀新的实验方法，对于从事生命科学研究工作者来说是非常重要和完全必要的。目前，适用于高等院校不同层次使用的细胞生物学实验教材不多。由于细胞生物学已成为重要的前沿生物学科，其发展速度之快可谓日新月异，突飞猛进，异常迅速。各种研究新方法、新技术如雨后春笋层出不穷。各学科之间的相互渗透，相互依存紧密相联。如细胞生物学与分子生物学、分子遗传学等实验技术之间就具有很强的依存性和相融性。细胞生物学实验技术的巨大变化，将推动细胞生物学向着更深的层次发展。我们为了紧跟学科发展的趋势，把握学科前进的方向，适应学科发展的要求，将多年来在教学和科研实践中积累及编写的细胞生物学技术编写成《细胞生物学实验》一书。旨在让学生能掌握细胞生物学研究的基本操作技能和新的实验技术，从细胞生物学的角度分析生物学中的问题，为独立进行研究打下基础。本书是王金发教授主编的《细胞生物学》的配套教材之一。全书共有64个实验，内容较丰富，知识面广，既包括常规的经典实验，又新增了不少与现代细胞生物学和分子生物学相关的新技术，如电穿孔和电融合技术、反转录病毒载体介导的基因转导技术、胚胎干细胞的培养和体外分化技术、流式细胞技术、细胞显微注射、共聚焦显微技术、细胞凋亡检测技术等。这些实验内容新颖、技术先进，可操作性强，对培养学生的动手能力、分析问题和解决问题的能力很有帮助。本书第1～4章由戚康标编写；第5～7章由何炎明编写；第8章由何炎明、张利红编写；第9、12章及附录由刘兵编写，并对全书进行文字编辑和校对；第10、11章由张利红、张为民编写；冯冬茹参加了部分实验的初稿编写工作。本书在编写过程中得到王金发教授的亲自指导和中山大学生命科学院的大力支持，在此表示感谢。由于编者的水平有限，难免出现错误，恳请广大读者给予批评指正。编者2004年3月6内容简介本书是王金发教授主持编写的细胞生物学配套实验教材。全书包括12章共64个实验，内容涵盖了部分经典的细胞学生物学实验，又新增了一些与现代细胞生物学和分子生物学相关的新技术。包括光学显微镜技术、电子显微镜技术、细胞形态结构观察、细胞化学、细胞生理、细胞分裂与染色体畸变、染色体技术与核型分析、细胞组织培养技术、细胞化学成分分离、核酸及蛋白质的、细胞工程技术定位检测，以及流式细胞技术、共聚焦显微技术、细胞凋亡检测技术等。本书可供综合性大学、农林、医学、师范院校本科生和研究生细胞生物学实验课教学使用，也可作为从事相关研究人员的参考用书，由于本书实验内容较多，在使用时可根据自身条件酌情选择。7目录第一章光学显微镜技术实验1普通光学显微镜的构造原理及使用方法实验2特殊显微镜的原理和使用实验3显微摄影技术实验4光学显微标本的制作技术第二章电子显微镜技术实验5透射电子显微镜实验6透射电子显微镜样品制备实验7扫描电子显微镜实验8扫描电子显微镜样品制备第三章细胞的形态结构实验9细胞形态结构与几种细胞器的观察实验10液泡系和线粒体的活体染色实验11植物细胞骨架的光学显微镜观察实验12细胞骨架的免疫荧光显示实验13细胞的超微结构实验14细胞的显微测量第四章细胞化学实验15DNA的细胞化学——Feulgen反应实验16RNA的细胞化学——Brachet反应实验17细胞中多糖和过氧化物酶的定位实验18细胞中酸性磷酸酶的定位实验19细胞中碱性磷酸酶的定位第五章细胞生理实验20小鼠巨噬细胞吞噬的观察实验21胞饮作用实验22细胞膜的通透性实验23细胞电泳第六章细胞分裂与染色体畸变实验24细胞的无丝分裂与有丝分裂实验25细胞减数分裂实验26环境因素及辐射诱变染色体改组的观察第七章染色体技术与核型分析实验27植物染色体标本的制备和观察实验28动物骨髓细胞染色体标本的制备实验29人体外周血淋巴细胞培养与染色体标本制备实验30人类染色体G带技术实验31植物染色体分带技术实验32人类体细胞染色体组型分析实验33染色体核仁组织区（NORs）的显示实验34姊妹染色单体色差分析技术第八章细胞和组织培养技术8实验35植物组织培养技术实验36原生质体的分离和培养实验37植物体细胞杂交——原生质体的融合实验38动物细胞原代培养实验39传代细胞培养实验40细胞的冻存与复苏实验41哺乳动物胚胎干细胞的培养和体外分化第九章细胞化学成分的分离实验42细胞核与线粒体的分级分离实验43完整叶绿体的分离实验44中期染色体的分离纯化实验45动物细胞基因组DNA的提取实验46植物基因组DNA的提取实验47细胞和组织总RNA的提取实验48琼脂糖凝胶电泳检测DNA片段第十章蛋白质、核酸的定位与检测实验49地高辛标记探针的Southern杂交实验50放射性标记探针的Northern杂交实验51Western印迹法（蛋白质印迹法）实验52蛋白质与蛋白质相互作用检测——酵母双杂交筛选实验53原位PCR实验54用ABC法进行蛋白质的免疫定位第十一章细胞工程技术实验55鸡血细胞的体外融合实验56磷酸钙沉淀法将DNA导入细胞实验57电穿孔和电融合技术实验58反转录病毒载体介导的基因转导实验59细胞显微注射技术第十二章其他技术实验60细胞放射自显影实验61流式细胞技术实验62荧光标记技术实验63细胞凋亡的检测实验64共焦显微技术及去旋技术附录附录1一些常用的换算附录2常用试剂及溶液的配制和使用附录3光学仪器保养与清洁的要点附录4常用缩写汇编附录5常用细菌培养基的配方主要参考书目9第一章光学显微镜技术显微镜是在人们认识到凸透镜放大作用的基础上发明的。据历史记载，12世纪阿拉伯人阿尔海琴（Anlagen）已会磨制透镜。1604年荷兰眼镜商詹森（Janssen）创造了第一台放大率不超过10倍的复式显微镜。半个多世纪后，英国物理学家胡克创制了第一架具有科学研究价值的显微镜，首次观察了木栓的显微图像，并发现了细胞。真正观察到活细胞的是荷兰科学家列文虎克，他用自制的显微镜观察到了池塘水中的原生动物，还有人和哺乳类动物的精子、细菌等。可以说没有显微镜的发明就没有细胞的发现。随着现代科学技术的发展，显微镜的种类越来越多，性能更加完善，使用范围也越来越广泛，不仅可以用来观察细胞形态和内部结构，而且，还可以通过与其他技术的结合，进行细胞化学成分的定位、定性、定量以及物质代谢、细胞生理、免疫和遗传等功能方面的研究，是细胞生物学研究中用途昀广的仪器之一，没有它也就无法打开生物界的微观大门。因此了解各种普通光学显微镜及其结构原理和操作方法具有重要的作用和意义。本章将介绍常用的普通光学显微镜和特殊显微镜的结构、原理、应用以及显微摄影技术。实验3显微摄影技术【实验目的】了解和初步掌握自动曝光显微摄影的方法。【实验原理】显微摄影是通过摄影装置拍摄显微镜视野中物体影像的过程，它是必备的一项常用显微技术。它的基本原理是将标本的图像，通过显微镜投射到感光材料（胶卷）上而成为永久性记录。【实验仪器、材料和试剂】OLYMPUS-BH系列显微镜装配的PM-10AD摄影装置，135全色胶卷，标本片或培养细胞。【方法与步骤】（一）对被摄样品的要求1．选用标准的载玻片和盖玻片。光源入射光束，经载片透射标本，再经盖片进入物镜。处于光路之中的玻璃，应是表面无伤痕，内无气泡、外无霉斑。这样可以杜绝光线乱反射，防止阻光，降低亮度以及有损清晰度。载玻片厚度不宜超出聚光镜的焦距，一般在1.5mm以内，可将光源的光束集中于载玻片的标本上。盖玻片的标准厚度为0.17mm，若使用厚度大于工作距离的盖片，物镜前透镜会触及盖玻片，同时不能准焦；盖玻片厚，球差就大，会10降低影像质量。有效盖玻片厚度，包括封固剂的厚度，即树胶或尤派胶用量，因此，封固剂要调稀，少许滴加一薄层。2．若拍摄染色体的标本，染色体应处于相宜的时期，平展逸散、完整无损。染色体的计数和组型分析，以有丝分裂的中期（或晚前期）、减数分裂的终变期为宜。这时染色体收缩变短，呈典型形态，易识别。通过前处理的精细加工，染色体相互逸散，互不接触，并尽可能使之平展于同一水平上，又不失细胞的完整轮廓。3．染色鲜明适度，标本过染，染料堆积，使样品模糊成一块难以辨别细节，缺乏质感；样品着色过浅，使影像不鲜明，辨认不清，反差不大；色彩鲜明，胶片易感受，拍摄效果好。4．清洁无尘，消除气泡。制片中的灰尘异物和气泡，有损影像的质量，妨碍观察。气泡为临时制片的常见弊病，小的气泡有碍观瞻；大的气泡连片，推挤染色体，堆积集中，损坏了好的影像，要随时滴加所用的临时封固液，消除气泡。（二）拍摄拍摄是显微摄影系列操作中的关键环节。在镜检观察中，发现极需摄下的影像，应即时拍照。拍摄前，先做好一系列的操作准备，例如，摄影物镜和目镜的合理组合、光路合轴、科勒照明，合理加用滤色镜、调准孔径光阑和视野光阑以及应用低速全色胶片等。这些操作彼此相关，缺一不可。然后转入取景、聚焦和曝光拍摄。1．取景和聚焦：显微摄影要通过摄影装置的侧视目镜取景器，对准拍摄的物体影像，选取适宜的物象进行拍照。（l）屈光度调节：取景聚焦前，首先进行屈光度调节，使目镜取景器适于各种不同视力者，达到准确的聚焦。在显微摄影装置的接头部位，有一筒状侧视目镜取景器，它由数片透镜组成。近眼端为屈光度调节环，能左右转动，变换透镜间距，改变焦点距离。调节环旋转调节的昀大范围为±5屈光度（一屈光度相当于眼镜的100度）。经过调节，使近（远）视眼在500度以内的人，可脱下眼镜取景调焦。在侧视目镜取景器内有一玻璃屏，上刻双十字线。调节时，左右转动屈光度调节环，使侧视目镜取景器镜筒的前端伸缩，改变焦距，至清晰地分辨出双十字线止。通过改变取景器的筒长，以辨清双十字线为依准。使不同视力者，在显微摄影时，都可做到精确的准焦，拍出清晰的底片，绝不会因视力不等，获得不同的拍摄效果。双十字线校准后，要保持不变，不能随意变动，以防焦距改变。取景聚焦，只需使用显微镜调焦螺旋。屈光度调节，仅改变目镜取景器的长度，不涉及被摄物体至暗箱焦平面的距离。当十字被看成双线时，聚焦的影像焦点，能清晰地投射在焦平面上；如果十字线被看成单线，即使影像是昀清楚的准焦，其焦点并不落在暗箱的焦平面上，而位其前后，底片影像模糊不清。当改变拍摄者或左右眼调换使用时，皆需重新迸行屈光度调节。（2）取景：取景决定拍摄的对象、范围和大小，专用摄影设备，用侧视目镜取景器取景。在刻有双十字线的玻璃屏上，同时刻有数种规格的长方形取景框。底片所摄下的范围，并非视野所见的全部，仅是圆形视野中的长方形部分。在可供系列暗箱共同使用的取景器中，有数种规格的取景框。取景时要准确选用，务使所用暗箱的规格与取景框的大小相符。拍摄的物体一经确定后，即要考虑拍摄的范围和大小（放大倍数）。例如，拍摄减数分裂的同步性，为展示植物花粉母细胞在花药中同步地进行减数分裂，拍摄的范围应大，在一张底片上，要有足够的数量同步分裂的花粉母细胞，以数量突出同步性。这时选用低倍的物镜和目镜拍摄。作为染色体计数和组型分析的摄影，拍摄的范围要小，每片要拍全一个细胞的染色体，尽可能利用取景框所能提供的范围，提高放大倍数，使染色体与取景框相接。取景时，要使被摄物体的影像中心位于长方形取景框的对角线中心，并使两者的长、短11轴相应。需要90°调整时，转动载物台或摄影装置，让影像轴和取景框横轴平行。影像大小用调换物镜和目镜控制。（3）聚焦：转动显微镜的粗细调丝螺旋，改变物镜前透镜和被检物体的距离，使视野中物体影像焦点聚于暗箱的焦平面上。纵横移动镜台上的制片标本、寻找拍摄的图像上下移动调焦螺旋，辨清物体的细微结构。取景聚焦，需几经反复。底片影像清晰度决定于拍摄前的昀终一次准焦。取景聚焦完毕，立即按下快门按钮。任何有关操作，都要在聚焦前完成。准焦后的微小颤动，也会引起焦点的改变，致使拍出的底片影像模湖不清。使用135胶片拍摄，卷片要在聚焦前完成，尤其使用镜臂升降的显微镜更应注意。加放滤色镜务必在聚焦前置于镜架上。摄影暗箱的焦平面要与载物台平行，否则