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细胞生物学实验讲义吴锦程梁杰编莆田学院环境与生命科学系生物技术专业2009年2月2目录1.前言.........................................................................................32.实验一普通光学显微镜及暗视野显微镜的使用......43.实验二荧光和相差显微镜及其使用...............164.实验三细胞膜的渗透性...................................................235.实验四细胞凝集反应.......................................................276.实验五叶绿体的分离与荧光观察...................................297.实验六线粒体与液泡的超活染色与观察.......................328.实验七酸性磷酸酶的显示方法(选做）........................369.实验八植物细胞原生质流动及其影响因素(选做）....3910.实验九植物细胞骨架的观察(选做）............................413前言细胞生物学是当前生命科学中核心学科之一，也是重要的专业基础课，其理论与实验技术已广泛地用于研究细胞的形态结构、基因表达与克隆、病毒、细菌、胚胎发育、远缘杂交、人类疾病的发病机制、药物机理等领域，随着分子生物学的研究渗入，分子细胞生物学也得到了突飞猛进的发展。目前许多综合大学、农业、医学及药科大学把细胞生物学作为本科生和研究生的必修课或基础理论课，同时也开设了专门的细胞生物学实验课，学生们通过实验，进一步地加深了对理论课的理解，也为今后的专业实验课和毕业论文实验奠定了基础。本讲义精心选择了细胞生物学中的常规实验，作为教材面向本系生物技术专业本科生进行讲授。4实验一普通光学显微镜及暗视野显微镜的使用一、实验目的1.强化普通光镜结构和使用技能的知识，掌握让其发挥最佳效能的方法。2.了解暗场显微镜的构造和原理，并掌握它们使用方法。二、实验用品1.材料与标本：载玻片、盖玻片、牙签，香柏油、生物永久装片、擦镜纸、洋葱。2.器材：普通光学显微镜，暗视场显微镜。三、实验内容和方法（一）普通光学显微镜1.显微镜的用途显微镜是用来观察、记录和研究经过制片技术处理后被检物体细微结构的最主要的光学精密仪器。400多年来，经不断改进，显微镜的结构和性能逐步完善，形成了品种繁多、型号各异的光学显微镜系列它广泛地应用于各学科领域中，对微观世界的探索及理论的研究起着极其重要的作用（如图1-1）。最常用的是普通光学显微镜，此外还有多种专用于不同显微术的显微镜，它们是利用不同的光学原理在显微镜基本设计的基础上发展而来的，如相差显微镜、暗视野显微镜、荧光显微镜和倒置显微镜等具有特殊功能或用途的光镜。形形色色的光学显微镜虽然外形和结构差异较大，但其基本构造和工作原理是相似的。5图1-1光学显微镜型号实例2.显微镜的一些基本知识普通光学显微镜的基本工作原理是利用物镜和目镜的多组凸透镜将物像逐级放大并反射到视网膜上的过程。而显微镜的性能和质量的高低可通过分辨率、数值孔径、总放大倍率等指标来反映。(1)分辨率：衡量光学系统分辨相隔微小距离的两个点能力的指标，即“能够分辨两点之间最小距离的能力”，称之为光学系统的分辨率。一个光学系统它所能分辨的两点之间的距离愈小，分辨率也就越高。显微镜的分辨率用公式表示为：d=0.61λ/NA式中d为最小分辨距离；λ为光线的波长；NA为物镜的数值孔径。可见物镜的分辨率是由物镜的NA值与照明光源的波长两个因素决定。NA值越大，照明光线波长越短，则d值越小，分辨率就越高。要提高分辨率，即减小d值，可采取以下措施:①降低波长λ值,使用短波长光源。②提高NA值。③消色差。④增加明暗反差。(2)数值孔径：数值孔径简写NA，数值孔径是物镜和聚光镜的主要技术参数，是判断两者（尤其对物镜而言）性能高低的重要标志。其数值的大6小，分别标科在物镜和聚光镜的外壳上。这里必须指出，为了充分发挥物镜数值孔径的作用，在观察时，聚光镜的NA值应等于或略大于物镜的NA值，数值孔径与其它技术参数有着密切的关系，它几乎决定和影响着其它各项技术参数。它与分辨率成正比，与放大率成正比，与焦深成反比，NA值增大，视场宽度与工作距离都会相应地变小。(3)放大率：放大率就是放大倍数，是指被检验物体经物镜放大再经目镜放大后，人眼所看到的最终图像的大小对原物体大小的比值，是物镜和目镜放大倍数的乘积，即：显微镜的总放大倍率=单个物镜的放大倍率×目镜的放大倍率。放大率也是显微镜的重要参数，但也不能盲目相信放大率越高越好，在选择时应首先考虑物镜的数值孔径。(4)焦深：焦深为焦点深度的简称，即在使用显微镜时，当焦点对准某一物体时，不仅位于该点平面上的各点都可以看清楚，而且在此平面的上下一定厚度内，也能看得清楚，这个清楚部分的厚度就是焦深。焦深大,可以看到被检物体的全层，而焦深小，则只能看到被检物体的一薄层，焦深与其它技术参数有以下关系：①焦深与总放大倍数及物镜的数值孔镜成反比；②焦深大，分辨率降低。由于低倍物镜的景深较大，所以在低倍物镜照相时造成困难。(5)视场直径（Fieldofview）：观察显微镜时，所看到的明亮的原形范围叫视场，它的大小，是由目镜里的视场光阑决定的。视场直径也称视场宽度，是指在显微镜下看到的圆形视场内所能容纳被检物体的实际范围。视场直径23最为科学，大视场容易引起场曲。F=FN/MobF:视场直径，FN：视场数，Mob:物镜放大率。视场数（FieldNumber,简写为FN），标刻在目镜的镜筒外侧。由公式可看出：①视场直径与视场数成正比；②增大物镜的倍数，则视场直径减小。因此，若在低倍镜下可以看到被检物体的全貌，而换成高倍物镜，就只能看到被检物体的很小一部份。(6)覆盖差：显微镜的光学系统也包括盖玻片在内。由于盖玻片的厚度不标准，光线从盖玻片进入空气产生折射后的光路发生了改变，从而产生7了像差，这就是覆盖差。覆盖差的产生影响了显微镜的成像质量。国际上规定，盖玻片的标准厚度为0.17mm,许可范围在0.16—0.18mm.,在物镜的制造上已将此厚度范围的像差计算在内。物镜外壳上标记0.17,即表明该物镜要求盖玻片的厚度。(7)工作距离：工作距离也叫物距，即指物镜前透镜的表面到被检物体之间的距离。镜检时，被检物体应处在物镜的一倍至二倍焦距之间。因此，它与焦距是两个概念，平时习惯所说的调焦，实际上是调节工作距离。在物镜数值孔径一定的情况下，工作距离短孔径角则大。数值孔径大的高倍物镜，其工作距离小。(8)机械系统：①镜筒：是安装在光镜最上方或镜臂前方的圆筒状结构或方形结构，其上端装有目镜，下端与物镜转换器相连（图1—2）。②物镜转换器：又称旋转盘，是安装在镜筒下方的一圆盘状结构，可8以按顺时针或逆时针方向旋转，其上均匀分布有3-4个圆孔，用以装载不同放大倍数的物镜。转动旋转盘可使不同的物镜到达工作位置（即与光路合轴），此时能听到“咔”的一声。③镜臂：是支持镜筒和镜台的弯曲状结构，是取用显微镜时握持的部位。④调焦器：也称调焦螺旋，是调节焦距的装置，位于镜柱的下端，左右对称各一套。分粗调螺旋（大螺旋）和细调螺旋（小螺旋）两种。粗调螺旋可使载物台以较快速度或较大幅度升降，能迅速调节好焦距，使物像呈现在视野中，适于低倍镜观察时的调焦。细调螺旋只能使载物台缓慢或较小幅度地升降，升或降的幅度不易被肉眼观察到，适用于高倍镜和油镜焦距的精细调节；也常用于观察标本的不同层次，一般在粗调螺旋调焦的基础上使用。有些类型的光镜，在左侧粗调螺旋的内侧有一窄环，称为粗调松紧调节轮，其功能是调节粗调螺旋的松紧度。另外，在右侧粗调螺旋的内侧有一粗调限位凸柄，当用粗调螺旋调准焦距后向上推紧该柄，可使粗调螺旋限位，此时镜台不能继续上升，但细调螺旋仍可调节。⑤载物台：也称镜台，是位于物镜转换器下方的方形平台，用于放置被观察的玻片标本。载物台的中央有圆形的通光孔，来自下方的光线经此孔照射到标本上。在载物台上装有标本移动器，也称推进器或推进尺，其上安装的弹簧夹用于固定玻片标本，载物台的左下方的两个螺旋可以移动推进器，可使玻片标本在水平面上前后左右移动，用来寻找目标。⑥镜柱：是连接镜臂与镜座的短柱，其上有调焦器。⑦镜座：位于最底部，是整台显微镜的基座，用于支持和稳定镜体。在镜座内装有照明光源。(9)光学系统:光学系统包括目镜和物镜。①目镜：又称接目镜，安装在镜筒的上端，起着将物镜所放大的物像进一步放大的作用。每个目镜一般由两个透镜组成，在上下两个透镜（即接目透镜和会聚透镜）之间安装有能决定视野大小的金属光阑——视场光阑，此光阑的位置即是物镜所放大实像的位置。因此，可将一小段细金属丝或头发粘附在光阑上作为指针，用以指示视野中的某一部分供他人观察。另外，还可在光阑的面9上安装目镜测微尺。每台显微镜通常配置2～3个不同放大倍数的目镜，如“5×”、“10×”和“15×”（数字表示放大倍数）目镜，可根据不同需要选择使用，最常使用的是“10×”目镜。②物镜：也称接物镜，安装在物镜转换器上。每台光镜一般有3—4个不同放大倍数的物镜，每个物镜由数片凸透镜组合而成，是显微镜最主要的光学部件，决定着光镜分辨力的高低。常用物镜的放大倍数有“10×”、“40×”和“100×”等几种。一般将“10×”物镜称为低倍镜（而将“5×”及以下的叫做放大镜），将“40×”或“45×”物镜称为高倍镜，将“100×”物镜称为油镜（这种镜头在使用时其顶端需浸在香柏油中）。在每个物镜的侧壁通常都标有能反映其主要性能的参数（图1-3），主要有放大倍数和数值孔径（如10/0.25、40/0.65、100/1.25）、该物镜所要求的镜筒长度和标本上的盖玻片厚度（160/0.17，单位为mm）；另外，在油镜上还常标有“油”或“oil”字样。物镜头与玻片标本之间的介质一般为空气。由于玻璃与空气的折光率不同，光线通过载玻片和空气进入物镜，部分光线产生折射而损失掉，导致进入物镜的光线减少，分辨率降低。而油镜用香柏油或石蜡油作为介质，香柏油或石蜡油折射率与玻璃近似（玻璃、香柏油和石蜡油的折射率分别为1.52、1.51和1.46，空气为1），可减少光线的折射，增加视野亮度，提高分辨率。物镜分辨率还和数值孔径有关，其数值越大，分辨率越高。不同物镜有不同的工作距离，所谓工作距离是指显微镜处于工作状态（焦距调好、物像清晰）时，物镜最下端与玻片上表面之间的距离（图1-3）。物镜的放大倍数与其工作距离成反比。当低倍镜被调节到工作距离后，可直接转换高倍镜，只需旋动细调螺旋，便可见到清晰的物像，这种情况称为同高调焦。不同放大倍数的物镜可从长短上加以区分，一般来说，低倍镜最短，油镜最长，而高倍镜的长度介于两者之间。10(10)照明系统：①聚光器：位于载物台通光孔的下方，由2—3个透镜组合而成，其主要功能是将光线集中到所要观察的标本上，增加视野的亮度。在聚光器的左下方，有一调节螺旋，可使其上升或下降，从而调节光线的强弱。升高聚光器可使聚光作用增强，反之则聚光作用减弱。②光圈：也称彩虹光阑或孔径光阑，位于聚光器的下端，是能够控制进入聚光镜光束大小的可变圆环结构。它由十几张金属薄片组合排列而成，其外侧有一小柄，可使光圈的孔径开大或缩小，以调节光线的强弱。有的显微镜光圈的下方还装有滤光片框，可放置不同颜色的滤光片。③光源：包括电源线及其插头和灯泡及其开关。电源线在镜柱下面的镜座侧面。用时将其插头插入电源插座中。灯泡在镜座上面中央位置，其开关在镜座上镜柱底部的左侧（有的显微镜开关在镜柱上）。可通过灯泡开关旋钮来调节光线亮度以适应不同的观察需要。3.光学显微镜的使用方法：(1)准备工作和基本要求：取用显微镜时，一手握住镜臂，另一手托住镜座，将显微镜平稳地放置在实验台上，镜座后缘离桌台边缘约5cm。用显微