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细胞工程实验课程组成员：杨慈清、李虎、王红霞、许重洁办公电话：3029114新乡医学院生命科学实验教学中心实验二细胞融合技术与染色体提前凝集标本制备实验一动物细胞的培养实验三小鼠MEF饲养层的制备实验五原生质体的分离、纯化和活力鉴定实验四MS培养基的配制和愈伤组织诱导目录实验一动物细胞的培养一、实验目的1.掌握干热灭菌法、湿热灭菌法和滤过除菌法的操作。2.了解化学消毒法的使用方法。3.了解传代细胞的传代方法及操作过程，学习观察体外培养细胞的形态及生长状况及细胞增殖动力学测定的方法。二、实验原理细胞培养是一种操作繁琐而又要求十分严谨的实验技术。要使细胞能在体外长期生长，必须满足两个基本要求：一是供给细胞存活所必需的条件，如适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度，注意外环境酸碱度和渗透压的调节。二是严格控制无菌条件。显微镜下的培养细胞三、实验方法1、玻璃器材的清洗处理方法2、塑料器材的清洗处理方法3、橡皮器材的清洗处理方法4、金属器材的清洗处理方法5、细胞的消化传代方法方法1、玻璃器材的清洗处理方法清洁液浸泡或用2%磷酸三钠或洁消精浸泡过夜自来水冲10次培养瓶再用三蒸水浸泡过夜晾干包装灭菌单蒸水洗2次晾干备用备用刷洗浸泡2、塑料器材的清洗处理方法用3%HCl或2%NaOH溶液浸泡过夜（单用或交叉处理）水洗10次单蒸水2次紫外线或辐射灭菌备用三蒸水浸泡过夜晾干刷洗浸泡3、橡皮器材的清洗处理方法5%NaOH煮10′～20′水洗4%盐酸煮10′～20′单蒸水洗三次、二蒸水洗一次晾干备用水洗8~10次刷洗浸泡金属器材的清洗处理方法纸擦去表面的油脂洗衣粉煮沸或用1%碳酸氢钠煮沸15分钟水洗95%酒精纱布擦干包装灭菌4、金属器材的清洗处理方法吸除或倒掉旧培养液加入2mL，无钙、镁PBS，漂洗一次后倒掉加入1mL消化液（0.25%胰蛋白酶或0.02%EDTA或混合液）肉眼可观察到“薄膜”现象时，倒掉消化液继续作用2～3分钟显微镜下可发现细胞回缩变圆，细胞间隙增大，此时应立即终止消化5、细胞的消化传代方法加入完全培养基5mL，用吸管反复吹打计数板计数分瓶培养细胞的消化传代方法生长细胞形态四、作业与思考1．简述细胞传代培养的操作程序及注意事项。2．细胞培养获得成功的关键要素是什么?3．简述体外培养细胞的形态特征及其生长阶段。4．绘制细胞生长曲线图。5．绘制细胞分裂指数图。实验二细胞融合技术与染色体提前凝集标本制备一、实验目的通过细胞融合技术，初步了解染色体提前凝集标本制备原理、方法及间期细胞三种时相的提前凝集染色体特点。二、实验原理M期细胞内有某种促进染色体凝集因子，它无种属特异性，所以在细胞融合和染色体技术的基础上，建立了制备染色体提前凝集标本的方法。即让M期细胞与间期（I期）细胞融合，从而诱导I期细胞染色质提前浓缩成染色体。形成的这种染色体称提前凝集的染色体(PrematurelyCondensedChromosome，PCC)。三、实验方法1、细胞融合方法2、PCC诱导和观察收集1瓶M期细胞、消化一瓶贴壁细胞混合离心用Hank’s液洗1次离心弃上清（吸干）轻弹使细胞分散90s后1、细胞融合方法37℃滴加50％PEG0.5ml（12滴）加入2ml1640（含10％血清）加一滴秋水仙素（10μg／ml）分别在5min、15min、20min观察细胞融合加入5ml1640洗一次（不要吹打）离心细胞融合90分钟后离心弃上清加入0.075mol/lKCl8ml混匀37℃25分钟加入1ml固定液混匀离心弃上清2、PCC诱导和观察加7ml固定液固定20min离心弃上清加0.5ml固定液滴片（冰、高、烤）Giemsa染色12min水冲、晾干、镜检四、作业与思考1.根据PCC图像的观察，试说明对于理解细胞周期和DNA复制有什么启示?2.简述细胞融合的原理。3.PCC实验的主要意义是什么？实验三小鼠MEF饲养层的制备一、实验目的1.掌握常用饲养层的制备原理和方法。2.巩固细胞培养相关的的技术。二、实验原理胚胎干细胞（embryonicstemcells,ES）的体外培养要求增殖的同时保持未分化的状态，因此，我们要进行体外培养胚胎干细胞，必须环境中满足两个条件：细胞生长因子和分化抑制因子。体外培养的成纤维细胞可以分泌细胞生长因子和分化抑制因子，前者可以促进ES细胞的增值，后者可以有效的抑制ES的自主分化。目前，可以用来制作饲养层的细胞有多种，其中原代小鼠胚胎成纤维细胞（mouseembryonicfibroblast,MEF）取材方便，易于铺层，分泌能力强而成为ES细胞首选的饲养层细胞。将原代培养的MEF细胞进行传代，多为3－6代，这样不仅可以使得MEF细胞的纯度较高，而且生长状态也很好。在制备饲养层前将MEF细胞用丝裂霉素C或射线照射预处理，抑制DNA的复制使其在保持分泌功能的基础上失去增值能力，以免与ES的生长发生竞争。在具体实验中，MEF细胞的原代分离时胎龄的选择，作为饲养层使用时细胞代数的选择，丝裂霉素处理的浓度都会影响饲养层培养体系的质量。胎龄过大，则成纤维细胞的成分降低，分离效率低下，且易混杂其他细胞，难以去处。若胎龄过小，胚胎形态小，躯干部分不易分辩，操作困难。细胞代数过多，则出现衰老征象；细胞代数过少，不容易纯化。丝裂霉素的浓度处理和处理时间直接影响细胞的状态。二、实验方法与步骤1.MEF的获取：（1）激素处理小鼠，同期发情和超数排卵（2）2：1合笼过夜（3）取出有阴道栓的开始记时间为0.5天（4）取出妊娠12.5-14.5天的小鼠为实验材料（5）无菌取出胚胎（6）去除头、尾、内脏和四肢，仅留躯干部（7）用眼科剪刀剪成1mm3组织块（8）0.25%胰蛋白酶消化20min/室温，每隔5min振荡一次（9）过滤（200目筛网）并收集滤液（含有单个的MEF）二、实验方法与步骤2.接种并进行原代培养（1）细胞计数，按照1*105个/ml接种于培养瓶中（2）48小时换液，4-5天后传代3.传代培养（1）传3-5代，并长满瓶底部，并换液备用于第二天处理4.丝裂霉素C处理细胞（1）用20mg/L和10mg/L以及空白组的丝裂霉素C处理2.5-3.5小时（2）弃去含有丝裂霉素C培养液小鼠胚胎成纤维细胞显微图体外培养的小鼠胚胎成纤维细胞二、实验方法与步骤5.冲洗（1）PBS冲洗3-6次，去除残余的丝裂霉素，加常规培养液，在5天内用于步骤66.常规胰蛋白酶消化，重新接种，贴壁后即可以应用（1）常规胰蛋白酶消化（2）单细胞悬液以1*106个/ml接种于经过0.1%明胶处理30min的培养瓶或者培养板中（3）贴壁后即可以使用四、注意事项无菌操作吹打细胞时要小心，用力均匀用酶消化时注意时间，不可过渡五、作业与思考1.细胞计数，绘制MEF细胞生长曲线，连续7天，至少5天。分三个处理20mg/L和10mg/L以及空白组2.做好原代培养工作，并在48小时换液时和4-5天传代时，仔细观察细胞形态和生长状态并记录结果，分析产生结果的原因。3.设计细胞培养室的理想布局，并且将仪器配备入内。4.掌握细胞培养过程中的常用方法。5.如何尽可能的做到无菌操作实验四MS培养基的配制和愈伤组织诱导一、实验目的通过掌握MS培养基母液配制及常用培养基的制备和灭菌方法，为植物组织培养准备合适的营养条件；掌握植物外植体的消毒技术、离体培养的无菌操作和愈伤组织诱导技术。二、实验原理植物材料培养要获得成功，并正常生长，培养基的成分是一个决定性因素，不同植物要求不同的培养基。大多数植物组织培养所用的培养基由无机营养物、碳源、维生素、生长调节物质和有机附加物等五类物质组成。二、实验原理由于细胞的全能性，在合适的生长条件下，一定浓度的细胞分裂素和生长素配比可以诱导植物的外植体脱分化产生愈伤组织，为进一步再分化创造条件。植物细胞全能性三、实验材料与器具高压灭菌锅、普通及精密天平、玻璃器皿（烧杯、1000、500mL容量瓶、移液管、试剂瓶、1000、500、100mL三角瓶）、化学试剂。四、实验步骤1、配制几种母液（1）配制100倍1LMS大量元素母液NH4NO3165gKH3PO417gKNO3190gCaCl2·2H2O44gMgSO4·7H2O37g四、实验步骤（2）配制MS微量元素母液配制成100倍1L母液，母液。依次称取KI0.083gNa2MoO4·2H2O0.025gH3BO30.62gCuSO4·5H2O0.0025gMnSO4·H2O1.69gCoCl2·6H2O0.0025gZnSO4·7H2O0.86g四、实验步骤（3）配制MS有机母液一般配制成100倍1LMS有机母液。依次称取肌醇10.0g盐酸硫胺素0.01g烟酸0.05g甘氨酸0.20g盐酸吡哆醇0.05g四、实验步骤（4）配制MS铁盐母液一般配制成100倍lLMS铁盐母液。依次称取EDTA二钠3.73gFeSO4·7H2O2.78g四、实验步骤2．植物激素的配制0.1mg/mL的6-BA溶液：取25mg的6-BA，用少量1N的盐酸溶解，再加蒸馏水定容至250mL。0.1mg/mLNAA：取25mg的NAA可溶于热水中或用少量95%乙醇或少量1N的NOH溶解后，再加水定容至250mL。四、实验步骤3．培养基的配制分别吸取母液各10mL及6-BA和NAA母液各20mL，混合后，再加蔗糖至终浓度3%，用NaOH调节pH至6.0；加入琼脂6g。最后加蒸馏水定容至于1L。然后用组织培养用封口膜封上，扎紧后灭菌。四、实验步骤4．培养基灭菌和分装将分装好的培养基放在高压灭菌锅中，加热，待压力上升到0.5kg/cm2时，排净冷空气，关闭放气阀继续加热使压力稳定在1.2kg/cm2，温度为121℃的条件下，维持15~20分钟。灭菌后的培养基冷却至65℃左右，分装，每100mL三角瓶装40mL，共装25瓶。四、实验步骤5．消毒液的配制次氯酸纳消毒液：取30mL次氯酸纳溶液，用蒸馏水定容至100mL。现配现用。75%的酒精：75mL的95%的酒精加水定容至95mL。四、实验步骤6．外植体的制备和接种将发芽的零余子用次氯酸纳消毒液或者75%的酒精消毒后移入超净工作台的无菌培养皿中，用解剖刀切取苗芽，然后将其接种在培养基上，一般每瓶接种4-5片苗芽。快速封好瓶口，并写上接种日期。四、实验步骤7．愈伤组织的诱导接种后的三角瓶置于24℃条件下，黑暗培养一周，然后在同样温度下分为光照和黑暗培养直至愈伤组织形成。五、注意事项配制铁盐母液时，FeS04和Na2EDTA应分别加热溶解后混合，并置于加热搅拌器上不断搅拌至溶液呈金黄色(约加热20-30min)，调pH值至5.5，防止FeS04结晶析出。五、注意事项因为高温灭菌会降低pH值（约0.2-0.3个pH值），配制时常提高pH值0.2-0.3。接种时严格注意无菌操作。六、作业与思考1．植物培养基为什么要分成母液分开配制。2.分析实验中植物愈伤组织生长所需要的必要条件。实验五原生质体的分离、纯化和活力鉴定一、实验目的1.学习植物细胞原生质体分离和纯化的方法。2.了解原生质体活性鉴定的原理。二、实验原理植物原生质体是除去细胞壁后为原生质所包围的“裸露细胞”，是开展基础研究的理想材料。其中，酶解法分离原生质体是一个常用的技术，其原理是植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素和果胶质组成，因而使用纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶能降解细胞壁成分，除去细胞壁，即可得到原生质体。由于原生质体内部与外界环境之间仅隔一层薄薄的细胞膜，必须保持在渗透压平衡的溶液中才能保持其完整性。其次,还应当考虑取材、酶的种类和纯度、酶液的渗透压、酶解时间及温度等因素对分离原生质体的影响。测定原生质体的活性有多种方法。荧光素双醋酸酯(FDA)染色是常用的一种方法，FAD本身无荧光，无极性，可透过完整的原生质膜。一旦进入原生质体后，由于受到酯酶分解而产生具有荧光的极性物质荧光素。它不能自由出入原生质膜，因此有活力的细胞能产生荧光，无活力的原生质体不能分解FAD无荧光产生。三、实验方法取材酶解过滤离