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目录实验一显微摄影术实验二细胞凝集反应与细胞膜的渗透性实验三线粒体和液泡系的超活染色与观察实验四叶绿体的分离与荧光观察实验五石蜡切片法实验六植物染色体标本的制备与观察实验七动物细胞培养原代细胞培养传代细胞培养与观察实验一显微摄影术一、实验目的掌握显微摄影装置及其操作技术;独立完成显微摄影全过程二、实验用品1.器材:复式显微镜及其摄影装置、黑白胶片、显影罐、温度计、电炉、暗房袋、暗盒、相纸、剪刀、塑料盘、烧杯、量筒、天平、生物样品等2.试剂:①显影液(D72通用显影液):用50℃蒸馏水150ml,先将小袋药粉溶解,再将大袋药粉放入,搅动至完全溶解,加水至250ml.待温度降至20℃左右时使用.②定影液:用50℃蒸馏水150ml将药粉完全溶解后,加水至250ml,待温度降至约20℃时使用.三、实验原理与方法显微摄影使通过摄影装置,拍摄显微镜视场中被检样品的光学影象的一种技术.具体实验步骤以简图表示如下:显微摄影装置的安装与调试显微镜的光路调整:通过调中,使照明光束与显微镜的光学系统的光轴合一.装入胶片取景聚焦暴光:1/15sec(应先测光:绿灯亮可以正确暴光)黑白胶片的冲洗:显影3min→停显10sec→定影15min→水洗:流水冲洗30min→晾干印相放大:取景聚焦→暴光→显影→停显10sec→定影15min→水洗:流水冲洗30min上光剪切四、实验结果与分析独立完成摄影操作、上交一张照片并对所拍摄的样品加以简要说明;分析拍摄中应注意的主要问题及改进措施.实验二细胞凝集反应与细胞膜的渗透性一、实验目的：了解细胞膜的表面结构；细胞膜的渗透性及各种物质进入细胞膜的速度。二、实验的原理：（一）细胞凝集反应细胞膜是由脂类双分子层镶嵌蛋白质构成的单位膜，而脂类和蛋白质又与糖分子结合为细胞表面的分枝状糖外被。凝集素是一类可逆结合特异糖基的蛋白质，具有使细胞凝集、血型鉴定、促进淋巴细胞分裂、防害抗虫等作用。凝集素使细胞凝集是由于它与细胞外被的寡糖链相连接，起到“桥”的作用。（二）细胞膜的渗透性细胞膜是细胞与环境之间进行物质与能量交换的一种选择性通透屏障，可选择性地控制不同物质进出细胞，各种物质跨膜运输的方式是不同的，物质的通透性是由物质本身属性和膜的结构性质（如脂溶性、分子大小、所带电荷等）共同决定的；另外物质穿膜的通透性还要受到细胞生理状态和环境条件（如麻醉剂、热、辐射、pH值、盐不平衡等）的影响。渗入红细胞内的物质，增加了细胞内的渗透压，使细胞外的水分进入红细胞，细胞膨胀破裂，称为溶血。由于各种物质透入细胞的速度不同，溶血的时间不同。三、实验用品1.器材:显微镜、天平、载玻片、滴管、离心管、烧杯、10ml移液管、试管、试管架2.材料:土豆块茎3.试剂:２％鸭血红细胞、PBS缓冲液、土豆、0.17mol/L氯化钠、0.32mol/L乙醇等试剂四、实验方法(一)细胞凝集反应1２％鸭血红细胞悬液制备新鲜鸭血加ＡＣＤ抗凝剂，生理盐水洗５次，每次２０００r/min，离心５min，按红细胞压积用生理盐水配成２％鸭血红细胞悬液．2土豆凝集素制备土豆２克，加１０mlＰＢＳ缓冲液，浸泡２h.3细胞凝集反应土豆凝集素１滴２％鸭血红细胞液１滴载玻片上混匀，静置２０min，镜检．４对照ＰＢＳ１滴２％鸭血红细胞液１滴（二）细胞膜的渗透性１低渗溶液试管一支：鸭血红细胞液１mlddH2O10ml轻摇混匀，观察颜色变化，若有溶血，记下自加入鸭血到溶液透明澄清的时间（注意结合镜检）．２等渗溶液0.17mol/L氯化钠、0.17mol/L氯化铵、0.17mol/L醋酸铵、0.17mol/L硝酸铵、0.12mol/L草酸铵、0.12mol/L硫酸铵、0.32mol/L葡萄糖、0.32mol/L甘油、0.32mol/L乙醇、0.32mol/L丙酮等８种溶液进行同样实验，步骤同上．五、结果与讨论1.简图表示血细胞凝集原理;2.以图表的方式记录细胞渗透性的实验结果并进行比较分析．实验三线粒体和液泡系的超活染色与观察一实验目的１观察动植物活细胞内线粒体、液泡系的形态数量与分布；２学习一些细胞器的超活染色技术．二实验原理活体染色是指对生活有机体的细胞或组织能着色但又无毒害的一种染色方法.其目的是显示生活细胞内的某些结构,而不影响细胞的生命活动和产生任何理化变化以致引起细胞死亡.活染技术可用来研究生活状态下的细胞形态结构和生理、病理状态.根据所用染色剂的性质和染色方法的不同,活体染色可分为体内活染与体外活染两类.体内活染是以胶体状的染料溶液注入动植物体内,染料的胶粒固定于细胞内某些特殊结构内以达到易于识别的目的.体外活染又称超活染色，是由活的动植物分离出部分细胞或组织小块，以染料溶液浸染，染料因其＂电化学＂特性与被染部分相互吸引被选择固定在活细胞的某种结构中而显色．但不是任何染料都可作为活体染色剂使用,一般应选择那些无毒或毒性小的碱性染料(易溶于类脂质)并配成较稀的溶液来使用.詹纳斯绿Ｂ和中性红两种碱性染料是活体染色中重要的染料，对线粒体和液泡系的染色各有专一性．詹纳斯绿Ｂ可专一性地对对线粒体进行活染,这是由于线粒体内的细胞色素氧化酶系的作用,使染料始终保持氧化状态(即有色状态),呈蓝绿色;而线粒体周围的细胞质中,这些染料被还原为无色的色基.中性红对液泡系的染色具有专一性,只将活细胞中的液泡系染成红色,细胞核和细胞质不着色,这可能与液泡中的某些蛋白质有关.三实验用品１器材：显微镜、恒温水浴锅、、剪刀、镊子、解剖刀、载玻片、盖玻片、吸管、牙签、吸水纸２试剂：①Ringer溶液氯化钠０.８５g氯化钾０.２５g氯化钙０.０３g②1/5000詹纳斯绿Ｂ溶液称取0.5g詹纳斯绿Ｂ溶于5mlRinger溶液中,稍加热(30-40℃)溶解,用滤纸过滤后,即为1%原液.取1ml1%原液加入49mlRinger溶液,即得1/5000工作液,将其装入棕色瓶中备用.最好现配现用,以保持充分的氧化能力.③1/3000中性红溶液称取0.5g中性红溶于50mlRinger液,稍加热(30-40℃)溶解,用滤纸过滤,装入棕色瓶中于暗处保存.临用前取1ml1%原液加入29mlRinger溶液,即得1/3000工作液,将其装入棕色瓶中备用.３材料：人口腔上皮细胞洋葱鳞茎内表皮细胞绿豆幼根根尖四实验方法（一）线粒体的超活染色与观察１人口腔黏膜上皮细胞线粒体的超活染色与观察载玻片于３７℃恒温水浴：1/5000詹纳斯绿Ｂ溶液２滴人口腔上皮细胞黏液牙签刮取染色１０－１５min，盖上盖玻片，吸去周围染液，显微镜下观察．２洋葱鳞茎内表皮细胞线粒体的超活染色与观察载玻片于３７℃恒温水浴：1/5000詹纳斯绿Ｂ溶液１滴洋葱鳞茎内表皮镊子撕取染色１０－１５min，吸去染液，加Ringer溶液１滴，盖上盖玻片，显微镜下观察．（二）绿豆幼根根尖液泡系的中性红染色观察载玻片于３７℃恒温水浴：初生绿豆幼苗根尖（１－２cm）纵切面切片１片1/3000中性红溶液１滴染色５－１０min，吸去染液，加Ringer溶液１滴，盖上盖玻片压扁根尖，显微镜下观察．五结果与分析１绘出人口腔上皮细胞洋葱鳞茎内表皮细胞示线粒体的形态与分布并简要分析；２绘出绿豆幼根根尖细胞示液泡系的形态与分布并简要分析．实验四叶绿体的分离与荧光观察一实验目的１通过植物细胞叶绿体的分离，了解细胞器分离的一般原理与方法；２了解菠菜叶绿体的形态、分布与数量．二实验原理组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心，是分离细胞器的常用方法．一个颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗粒的大小、形状、密度、离心力及介质黏度等．同一离心场中，同一时间内，密度和大小不同的颗粒沉降速率不同．依次增加离心力和离心时间，就能使非均一的悬浮液中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部，从而可分批收集各种亚细胞成分．在等渗溶液中将叶绿体匀浆液在１０００r/min的条件下离心２min，去除其中的组织残渣和未破碎细胞，再在３０００r/min的条件下离心５min，即得沉淀的叶绿体．三实验用品１器材离心机、组织捣碎机、显微镜、天平、离心管、纱布、烧杯、量筒、滴管、载玻片、盖玻片２材料新鲜菠菜３试剂０.３５mol/L氯化钠溶液四实验方法（一）叶绿体的分离与观察１取新嫩菠菜叶，洗净檫干后去除叶梗和粗脉，称３０g于１５０ml０.３５mol/L氯化钠溶液中，装入组织捣碎机；２利用组织捣碎机低速匀浆３－５min；３将匀浆用６层纱布过滤于５００ml烧杯中；４取滤液４ml在１０００r/min下离心２min，取上清；５上清液３０００r/min，离心５min．去上清，沉淀即为叶绿体；６０.３５mol/L氯化钠溶液悬浮沉淀；７取叶绿体悬液１滴于载玻片上，加盖片：普通光镜下观察；（二）菠菜叶徒手切片观察新嫩菠菜叶斜切面１片０.３５mol/L氯化钠溶液１滴加盖片轻压：光镜下观察；五实验结果与分析记录所观察结果并加以简要描述;实验五石蜡切片法一实验目的学习石蜡切片法,观察染色结果,了解其反应原理.二实验原理DNA经弱酸(1mol/LHcl)水解,其上的嘌呤碱和脱氧核糖之间的键打开,使脱氧核糖的一端形成游离的醛基,这些醛基在原位与Schiff试剂(无色品红亚硫酸钠溶液)反应,形成紫红色的化合物,使细胞内含有DNA的部位呈紫红色阳性反应.紫红色的产生,是由于反应产物的分子内含有醌基,醌基是发色团,因此具有颜色.对照组预先用热三氯醋酸处理,抽提去细胞中的DNA而得到阴性反应,从而证明了Feulgen反应的专一性.三实验用品1材料Carnoy液固定的洋葱根尖切片2试剂①Carnoy固定液:3份95%酒精加1份冰醋酸;②1mol/LHcl:取比重1.18的浓盐酸82.5ml,加水至100ml;③Schiff试剂:先将200ml蒸馏水煮沸,由火上取下,加入碱性品红1g,充分搅拌溶解.待溶液冷至50℃时,过滤到磨口棕色试剂瓶中.加入1mol/LHcl20ml,冷至25℃时加入1g偏亚硫酸钠充分振荡后盖紧瓶塞,放于暗处过夜.次日取出,呈淡黄色或近于无色,加中性活性炭一匙,约0.5g,剧烈振荡1min,过滤后即得无色品红.外包黑布与冰箱内贮存.④亚硫酸钠水溶液(漂白液)10%偏重亚硫酸钠水溶液5ml,蒸馏水100,5,摇匀,塞紧瓶塞.应现配现用,防止因SO2的逸出而失效.⑤0.5%固绿酒精溶液(95%酒精溶解)⑥5%三氯醋酸、四实验方法石蜡切片↓溶蜡二甲苯I(3-5min)↓溶蜡二甲苯II(3-5min)↓1/2纯酒精+1/2二甲苯(3-5min)↓纯酒精I(2-3min)↓纯酒精II(2-3min)↓95%酒精(2-3min)↓83%酒精(2-3min)↓70%酒精(2-3min)↓对照组蒸馏水---------------------------------→5%三氯醋酸,90℃,15min∣实↓∣验70%酒精(2-3min)↓组↓1mol/LHcl←-----------------------------蒸馏水(过一下)↓1mol/LHcl60℃,8-15min(水浴)↓Schiff试剂(60-90min)↓亚硫酸水(IIIIII)(各5min)↓流水冲洗(5-15min)↓蒸馏水↓0.5%固绿酒精溶液(1min)(此步注意防止过染)↓蒸馏水↓70%酒精↓83%酒精↓95%酒精↓纯酒精I↓纯酒精II↓纯酒精III↓透明二甲苯I↓透明二甲苯II↓封片(贴上标签,注明材料,反应名称,作者姓名及日期)显微镜下观察:实验组:细胞核呈紫红色,核仁及细胞质呈绿色对照组:因DNA被提取破坏,细胞核无紫红色五实验结果与讨论1验交Feulgen反应制片1张;2简图表示Feulgen反应的染色结果;3说明Feulgen反应中设立对照组的必要性.实验六植物染色体标本的制备与观察一、实验目的学习植物染色体标本的制各技术，字握染色体的计数了解染色体的生物学意义二、实验用品1、材料洋葱根尖2、试剂1．Carnoy固定液2．0.1％秋水仙素溶液卡宝品红染液配方I原液A：称取3g碱性品红，溶于l00ml70％酒精中(此液可无限期保存)。原液B：取10ml原液A，加入90ml15