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1实验篇实验一细胞的形态观察及其大小测量【实验目的】1、通过对原核和真核各种形态细胞的光学显微镜观察，了解细胞的形态及其显微结构；2、学习显微测量的方法，对细胞的大小有一直观认识。【实验用品】普通光学显微镜;目镜测微尺;镜台测微尺;载玻片;盖玻片等。【实验材料】小白鼠肝细胞切片;鸡血红细胞;蚕豆叶片横切片;洋葱。【实验内容和方法】(一)细胞形态观察l、动物细胞的观察（1）人肝细胞切片：在显微镜下仔细观察肝细胞的形态构造。注意肝细胞之间的界限、细胞的形状、细胞核的形状和数量、核仁的形状和数量、细胞质的形态构造以及细胞质和细胞核染色的区别。（2）鸡血细胞涂片的观察：注意观察血细胞的组成；红细胞、白细胞、血小板的形态特点。2、植物细胞的观察（1）取蚕豆叶片横切片的观察：注意表皮细胞和叶肉细胞的基本结构。（2）洋葱表皮细胞的形态观察：用镊子撕取洋葱表皮，滴一滴蒸馏水，盖上盖玻片。在显微镜下观察的形态和结构。（二）细胞的大小和测量1、测微尺的使用目镜测微尺是一块圆形玻片，中心刻有一尺，长5～10mm，分成50～100格。每格的实际长度因不同物镜的放大率和不同镜筒长度而异。镜台测微尺是在一块载玻片中央，用树胶封固一圆形的测微尺，长1mm或2mm，分成100格或200格，每格的实际长度0.01mm(10μm)。当用目镜测微尺来测量细胞的大小时，必须先用镜台测微尺核实目镜测微尺每一格的长度。方法如下：(1)卸下目镜的上透镜，将目镜测微尺刻度向下装在目镜的焦平面上，再旋上目镜的上透镜。(2)将镜台测微尺刻度向上放在镜台上夹好，使测微尺分度位于视野中央。调焦至能看清镜台测微尺的分度。(3)小心移动镜台测微尺和转动目镜测微尺(如目镜测微尺分度模糊，可转动目镜上透镜进行调焦)，使两尺左边的一直线重合，然后由左向右找出两尺另一次重合的直线(如图所示)。(4)记录两条重合线间目镜测微尺和镜台测微尺的格数。按下式计算目镜测微尺每格等2于多少μm：0123测定目镜测微尺每格实长的图解上尺：目镜测微尺；下尺：镜台测微尺镜台测微尺的格数目镜测微尺每格的微米数=—————————×10目镜测微尺的格数例如，图中镜台测微尺1格=目镜测微尺6格，代入公式得：目镜测微尺每格=1／6×10μm=1.66μm(5)取下镜台测微尺，换上需要测量的玻片标本，用目镜测微尺测量标本。2、计算：根据测量结果计算各种细胞及细胞核的体积。椭球形：V=4πab2／3a-长半径b-短半径圆球形：V=4／3πr3r-半径圆柱形：V=πr2hr-半径h-高【作业与思考】1、血细胞分为哪几大类？分别描述你看到的不同血细胞的形态，并阐述其功能。绘图。2、任意选择你所看到的动物细胞和植物细胞各一个，绘图并进行适当标注，测量其大小，并比较动植物细胞大小的差异。3、在不同的放大倍数下，所测得的细胞大小一致吗？你认为在哪个放大倍数下测定得比较准确？为什么？实验二PAS（PeriodicAcidSchiff）反应显示糖原和其它多糖物质【实验目的】1、熟悉PAS法原理及操作步骤；2、观察PAS反应的染色结果，并观察多糖在组织细胞中的分布。【实验原理】多糖(polysaccharide)是由多个单糖分子缩合脱水而生成的化合物。广泛分布于动、植物界。一些不溶性的多糖构成植物和动物的骨架，如植物的纤维素和动物的甲壳素，一般称为结构多糖。另一些多糖在生物体内作为能量贮存，如淀粉（植物）和糖元（动物），在需要3时可以通过生物体内酶系统的作用分解，释放出单糖。还有许多多糖具有更复杂多样的生理功能，如粘多糖、血型物质等，它们在生物体内起着重要的作用。淀粉和糖原均由D－葡萄糖的分支或直链组成，过碘酸是一种强氧化剂，能将葡萄糖中的乙二醇基(CHOH-CHOH)氧化成两个游离的醛基(-GHO)，游离醛基与Schiff试剂反应生成紫红色产物。【实验用品】(一)试剂：1、过碘酸酒精溶液：取过碘酸（HIO4·2H2O）0.4g溶于35m1纯酒精中，加入5m1的0.2M醋酸钠（醋酸钠2.72g溶于100m1蒸馏水中），再加入15ml蒸馏水。溶液配好后保存在0℃～4℃的冰箱内，并加黑纸保存，此液如显黄色即失效。2.Schiff试剂：将0.5g碱性品红加入100m1煮沸的蒸馏水中，时时摇荡玻璃瓶或者搅拌，煮5min，使之充分溶解；然后冷却至50℃时过滤到具有玻塞的棕色试剂瓶，加入10ml的lmol／L的HCl，冷却至25℃时加入0.5g偏重亚硫酸钠，在室温黑暗条件下静置24h，其颜色呈褐色或淡黄色，加活性炭0.5g剧烈振荡摇匀1min；过滤，滤液为无色。置棕色瓶密封，外包黑纸，4℃保存。本试剂可提前一天准备，此液必需保持清澈透明、无色也无沉淀，容器要小，装满后仅留很小的空隙，其中不应有任何氧化剂，不要过长时间暴露在空气中。如有白色沉淀就不能再用，如颜色变红可以加入少许偏重亚硫酸钠，使其再转变为无色就可以再用。3、亚硫酸水溶液：取10％偏重亚硫酸钠Na2S2O5（或K2S2O5）20ml、1mmolL-1HCl20ml和400ml纯水混匀即可。此液使用前配制，否则会因SO2逸出失效。（此液中所用的偏重亚硫酸钠或钾要与Schiff试剂中所用的相同）：4、苏木精溶液常用的有5种，其中德拉菲氏苏木精染液(Delafield苏木精染液)配法如下:甲液（苏木精5g、无水乙醇30ml）乙液（铵矾，即硫酸铝铵饱和水溶液：比例为1g硫酸铝：11ml水，用时配110ml,取100ml）丙液（甘油125ml、甲醇125ml）。配法如下：1.将甲液一滴一滴地加入乙液中，并随时用玻璃棒搅动；2.然后暴露于阳光和空气中约1周到10天；3.加入丙液；4.将混合液静置2个月至颜色变深为止（可过滤），此液成熟后须置于阴冷处塞紧瓶口，可长期保存使用，使用时可将染剂1份用3～5份蒸馏水稀释，则染色后分化更明显。５、梯度乙醇溶液：100％，95％，90％，80％，70％，50％各两份。一份用于脱腊复水，一份用于脱水。６．二甲苯7、100%乙醇+二甲苯（1：1）（二)）用具：载玻片、盖玻片、染色缸、显微镜、小烧杯、胶头滴管、镊子、刀片（三）材料：土豆；小鼠肝细胞石蜡切片【实验步骤】（一）土豆切片的观察制作土豆徒手切片→过碘酸处理15～30min→70%乙醇1min→schiff试剂154min→亚硫酸水漂洗2～3次→蒸馏水漂洗→镜检（二）小鼠肝细胞切片的观察取鼠肝石蜡切片→二甲苯脱蜡约10min→二甲苯+100%乙醇（3min）→梯度乙醇脱二甲苯，在各浓度乙醇（100％，95％，90％，80％，70％，50％）中约2～3min→过碘酸氧化15～30min→蒸馏水漂洗→Schiff试剂15～30min→亚硫酸水漂洗2～3次→蒸馏水漂洗→苏木精染色10min→流水冲洗→梯度乙醇脱水（50％，70％，80％，90％，95％，100％），在各乙醇浓度中约2～3min→100%乙醇+二甲苯2～3min→二甲苯适度透明→指甲油封片→镜检【作业与思考】1、为所观察到的土豆切片和鼠肝切片绘图，标注其多糖的位置，并描述这两种细胞的多糖分布特点。2、影响PAS反应染色效果的关键步骤是什么？3、如何制作徒手切片？应注意什么才能得到薄而均匀的切片？【注意事项】1.过碘酸氧化作用时间稍长，会使反应更加充分。2.Schiff试剂作用时间略长，会使染色效果明显，但过长将导致染色太深，也不利于观察。3.二甲苯溶解性很强，时间要把握好，前者以脱蜡为准，不要有空气，后者以透明为准。如果片子变黑，重新放回二甲苯，再透明一次。4.试剂重复使用后，实验结果不明显（脱蜡不完全、染色不好等），因此在实验中要检查各试剂是否干净，如果污染严重，一定要更换。实验三叶绿体的分离与荧光观察【实验目的】1、通过植物细胞叶绿体的分离,了解细胞器分离的一般原理和方法.2、观察叶绿体的自发荧光和次生荧光,并熟悉荧光显微镜的使用方法.【实验原理】将组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心，是分离细胞器的常用方法。叶绿体的分离应在等渗溶液(0.35mol/L氯化钠或0.4mol/L蔗糖溶液)中进行,以免渗透压的改变使叶绿体到损伤。将匀浆液1000r/min的条件下离心2min,以去除其中的组织残渣和未被破碎的完整细胞。然后，在3000r/min的条件下离心5min，即可获得沉淀的叶绿体(混有部分细胞核)。分离过程最好在0~5℃的条件下进行，如果在室温下，要迅速分离和观察。某些物质在一定短波长的光（如紫外光）的照射下吸收光能进入激发态，从激发态回到基态时，就能在极短的时间内放射出比照射光波长更长的光（如可见光），这种光就称为荧光。若停止供能，荧光现象立即停止。有些生物体内的物质受激发光照射后，可直接发出荧光（称为自发荧光），如叶绿素的火红色荧光。有的生物材料本身不发荧光，但它吸收荧光染料后同样也能发出荧光（称为间接荧光），如叶绿体吸附吖啶橙后可发橘红色荧光。本实验利用荧光显微镜对发荧光的叶绿体进行观察。利用荧光显微镜对可发荧光的物质进行检测时,将受到许多因素的影响,如温度,光,淬灭剂等。因此在荧光观察时应抓紧时间,锲而舍之，朽木不折；锲而不舍，金石可镂。5有必要时立即拍照。另外,在制作荧光显微标本时最好使用无荧光载片、盖片和无荧光油。【实验用品】1.器材：1）主要设备:普通离心机,粗天平,荧光显微镜；2）小型器材:剪刀，研钵，移液管，漏斗，滴管,10ml刻度离心管,纱布若干,无荧光载玻片和盖玻片。2.材料：新鲜菠菜。3.试剂：0.35mol/L氯化钠溶液,0.01%吖啶橙(acridineorange).0.01%吖啶橙的配制：称取0.1g吖啶橙加蒸馏水100ml做干液，贮棕色瓶，置4℃冰箱保存。放冰箱备用，临用前取1ml母液加1/15mol/L磷酸缓冲液（pH4.8）9ml稀释。吖啶橙（AcridineOrange，AO）是一种荧光色素，其激发滤光片波长488nm。阻断滤光片波长515nm。它与细胞中DNA和RNA结合量存在差别，可发出不同颜色的荧光（即着色特异性），这是由于DNA是个高度聚合物，吸收荧光物质的位置较少，发绿色荧光，而RNA聚合度低，能和荧光物质结合的位置多，故发红色荧光。【实验方法】1、叶绿体的分离（1）选取新鲜的菠菜嫩叶，洗净擦干后，去除叶梗及粗脉并剪碎，称取2g左右，置于预冷的研钵;（2）加10ml的0.35mol•L-1NaCl溶液研磨匀浆;（3）用6层纱布过滤，滤液盛于烧杯中;（4）取滤液4ml于1000rpm离心2min，弃去沉淀;（5）将上清液3000rpm离心5min，弃去上清液，沉淀即为叶绿体（混有部分细胞核）；（6）沉淀用0.35molL-1NaCl溶液悬浮。2、叶绿体的观察（1）滴叶绿体悬浮液一滴于载片上，加盖片；在普通光镜下观察，注意观察所分离的叶绿体的形态以及其是否完整。（2）滴叶绿体悬浮液一滴于无荧光载片上，加无荧光盖片；在荧光显微镜下观察叶绿体有无自发荧光，其颜色如何。（3）滴叶绿体悬浮液一滴在无荧光载片上，再滴加一滴0.01％吖啶橙荧光染料，加无荧光盖片后即可在荧光显微镜下观察其次生荧光。3.完整细胞中的叶绿体观察（1）用镊子撕取一片菠菜叶子表皮，平铺于载玻片上，滴加一滴提取缓冲液，加盖片后轻压，备用。（2）用镊子撕去菠菜叶子的表皮，用刀片刮下一些叶肉细胞，放于载玻片上，滴加一滴提取缓冲液，加盖片后轻压，备用。（3）将以上两种制片进行一下三种方式的观察：a在普通光镜下观察。b在荧光显微镜下观察。锲而舍之，朽木不折；锲而不舍，金石可镂。锲而舍之，朽木不折；锲而不舍，金石可镂。锲而舍之，朽木不折；锲而不舍，金石可镂。6c再滴加一滴0.01％吖啶橙荧光染料，加无荧光盖片后，在荧光显微镜下观察。【注意事项】要得到完整的、有活性的叶绿体，须低温下迅速提取，涂片后立即观察。【作业与思考】1.描述你所观察到的实验现象，自发荧光和次生荧光的区别？2．叶绿体分离的原理是什么？操作过程中应注意什么？实验四吖啶橙(acridineorange)染色观察口腔上皮荧光【目的要求】1、熟悉荧光显微镜的原理及使用方法