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生物样品分离技术进展药学院药学院彭彦一、生物样品预处理二、双水相萃取三、反胶团萃取四、超临界流体萃取五、固相萃取六、分子印迹技术内容一、生物样品预处理•生物样品预处理（样品的制备）——对样品采用合适分解和溶解及对待测组分进行分离、纯化、浓缩的过程,使被测组分转变成可测定的形式以进行定量、定性分析检测。•样品前处理的目的——消除基体干扰，提高方法的准确度、精密度、选择性和灵敏度。•生物样品的预处理是体内药物分析的一个重要步骤，也是整个分离分析过程中最烦琐的一个环节。二、双水相萃取（Aqueoustwo-phaseExtraction）•双水相萃取——利用物质在不相溶的，两水相间分配系数的差异进行萃取的方法。•将两种不同的水溶性聚合物的水溶液混合时,当聚合物浓度达到一定值,体系会自然地分成互不相溶的两相。•这一现象早在1896年就由Beijerinck观察到了,当明胶与琼脂或明胶与可溶性淀粉的水溶液混合时,就得到一个浑浊不透明的溶液,它随之分成两个液相,这就是双水相体系。2009-11-2061.双水相的形成如：聚乙二醇/葡聚糖上、下相hydrophobichydrophilic2009-11-2072.常见的双水相系统3.萃取原理•生物物质进入双水相体系后，由于表面性质、电荷作用和各种力（如憎水键、氢键和离子键等）的存在和环境因素的影响，使其在上、下相中分配系数K不同,因而双水相体系对各类蛋白质的分配具有较好的选择性。4.双水相系统影响因素（1）聚合物及其分子量的影响：（选择性）（2）pH值的影响（3）离子环境对蛋白质在两相体系分配的影响（4）温度的影响5.具体实验步骤•配制一系列不同浓度、pH及离子强度的双水相,每个双水相改变一个参数。•加入料液,再加水使整个系统质量达到一定量，离心管封口后充分混合;•在1800~2000g下离心3~5min，使两相完全分离;•小心地用吸管或移液管将上相和下相分别吸出，测定上、下相中目标产物的浓度或生物活性。•再结合其他生化分离方法，从分开的两相中进一步分离纯化，获得所需的目标产物。6.应用（1）双水相萃取细胞中酶的流程图2009-11-2012微胶囊双水相萃取柑桔精油工艺流程图（2）小分子化合物富集分离2009-11-20137.双水相萃取的优点•平衡时间短、含水量高、界面张力小，特别适合于生物活性物质(蛋白质、酶、核酸、人生长激素、干扰素等)、天然植物中提取有效药用成分的分离纯化。•分离时间短，目标产物的分配系数一般＞3，即收率较高。•操作简便，易于放大。2009-11-2014三、反胶团萃取法ReversedMicellesExtraction1977年，Luisi等首先发现胰凝乳蛋白酶可以溶解于含表面活性剂的有机溶剂中，超离心数据显示有机相中有反胶束的存在，同时，光谱分析（紫外-可见光谱、荧光光谱、旋光光谱）表明这一过程未引起酶的变性。2009-11-20151.正胶团（normalmicelle）micelle极性头部疏水尾部在水中（一）反胶团基本性质表面活性剂的极性头朝外，疏水的尾部朝内，中间形成非极性的“核”。2009-11-20162.反胶团（reversedmicelle）reversedmicelle在有机溶剂中d——水池的直径W0——有机相中水与表面活性剂的摩尔比，称为含水率（watercontent）polarcoreWaterpoold∝W0表面活性剂的极性头朝内，疏水的尾部向外，中间形成极性的“核”。2009-11-20173.反胶团萃取体系常用二-（2-乙基己基）-琥珀酸酯磺酸钠(AOT)AOT/异辛烷系统W0=40d=12~14nm（1）单一反胶团体系（2）混合反胶团体系3两种或两种以上表面活性剂构成的体系。3一般说来，混合表面活性剂反胶团体系对蛋白质有更高的分离效率。3如AOT／DOLPA体系、AOT／Tween-85体系。（3）亲和反胶团体系3亲和反胶团体系是在反胶团中加入与目标蛋白有特异亲和作用的助表面活性剂形成。3采用这种体系，可使蛋白质萃取率和选择性大大提高，并可使操作范围（如pH、离子强度）变宽。这些优点使亲和反胶团体系已成为目前研究的一个热点。2009-11-20182009-11-2019（三）反胶团的溶解作用cb2009-11-2020萃取过程（forwardextraction）蛋白质从水相转移到反胶团中反萃取过程（backwardextraction）在界面处溶质（蛋白质）从反胶团内释放出来。与萃取条件相反。（四）蛋白质的选择性分离Fig.Schematicrepresentationofmechanismofproteinsolubilizationintoandfromreversemicellarphase2009-11-2022表面活性剂的种类溶液的pH值水池内离子强度1.静电相互作用2.疏水性相互作用盐析空间排阻3.温度（五）影响因素2009-11-2023（六）应用1.2.在药物中的应用3利用AOT/异辛烷反胶团溶液分离了红霉素、土霉素、青霉素等，而且回收率较高，作者还在温和实验条件下，直接从发酵液中分离了土霉素，且未发现该抗生素效价损失。3亲和配体胆甾醇D-丙氨酰-D-丙氨酸酯固定于AOT/异辛烷反胶束溶液中，分离糖肽类抗生素—万古霉素(pI8.1)。2009-11-20242009-11-2025（七）反胶团的优点1.极性“水核”具有较强的溶解能力。生物大分子可溶解于极性水核中，减少变性作用。2.由于“水核”的尺度效应，可以稳定蛋白质的立体结构，增加其结构的刚性，提高其反应性能。3.反胶团萃取技术具有高选择性、易放大、萃取相可循环利用以及分离和浓缩同步进行。2009-11-2026四、超临界流体萃取（SupercriticalFluidExtraction，SFE）（一）超临界流体（SupercriticalFluid）利用被分离物质与杂质在超临界流体中的溶解度不同而达到分离的一种萃取技术。T＜Tc时，液态和气态共存T＞Tc时，则只存在一相（超临界）流体状态GasLiquidTPSupercriticalFluid2009-11-2027SCF是指其温度和压力都超过其临界点的流体SupercriticalFluidTriplepoint三相点PcH2O=22.05MPaTcH2O=374.3℃Criticalpoint临界点2009-11-20281.气体、液体和超临界流体的性质（二）超临界流体性质超临界流体兼有液体和气体的双重特性，扩散系数大，粘度小，渗透性好。2009-11-20292.超临界流体的物理常数2009-11-2030超临界流体的溶剂强度取决于萃取的温度和压力。利用这种特性，只需改变萃取剂流体的压力和温度，就可以把样品中的不同组分按在流体中溶解度的大小，先后萃取出来，然后借助减压或升温的方法使SCF变成普通气体，被萃取物质则自动完成或基本析出。（三）超临界流体萃取的基本原理2009-11-2031（四）超临界流体萃取1.超临界流体的选择性•提高溶剂选择性的基本原则是：①操作温度应和超临界流体的临界温度相接近；②超临界流体的化学性质应和待分离溶质的化学性质相接近。2.萃取条件的选择3用同一种流体选择不同的压力来改变提取条件3超临界流体中的溶解性来选择合适的提取条件3将分析物沉积在吸附剂上，用超临界流体洗脱3对极性较大的组分，可直接将甲醇加入样品中2009-11-20323.影响超临界流体萃取的因素3萃取压力的影响3萃取温度的影响3萃取颗粒大小3CO2的流量3夹带剂的选择2009-11-20332009-11-20341.常温、高压下操作，适宜于热敏、不稳定物质的提取、分离；2.高密度流体，凝聚力和溶解力与液体接近；3.粘度小、扩散系数大，易达到相平衡；4.溶质、溶剂易于分离，萃取产物无残留毒性。（五）超临界流体萃取的特点2009-11-2035（六）超临界萃取装置超临界萃取主要由萃取阶段和分离阶段两部分组成。2009-11-2036超临界二氧化碳萃取流程图2009-11-20371．医药工业干燥和制粒、除杂质、灭菌、重结晶…2．食品工业植物油、香料、脱色脱杂质…3．化妆品工业天然香精、天然表面活性剂…4．环境保护环境污染物、水果中农药、废水处理…（七）应用2009-11-2038五、固相萃取SolidPhaseExtraction（SPE）是一种试样的预处理技术，它是以液相色谱分离机理为基础，建立起来的分离、纯化和富集的方法。常用于GC、LC、IR、MS、NMR、UV、AAS等各种分析方法的样品预处理。2009-11-2039SPE样本制备技术特点1.除去干扰物，净化样品；2.富集痕量分析物；3.减少溶剂使用和废物产生；4.多种键合固定相选择性；5.可批量进行；节省时间；6.可消除乳化现象；7.易于自动化；8.回收率高、重现性好。2009-11-2040属于液-固分离，物质从液相萃取到固相。利用固体吸附剂将液体样品中的目标化合物吸附，与样品的基体和干扰化合物分离，然后再用洗脱液洗脱或加热解吸附，达到分离和富集目标化合物的目的。（一）原理2009-11-2041SPE过程可分为吸附和洗脱两个部分2009-11-2042（二）固相萃取的模式反相固相萃取正相固相萃取离子交换固相萃取①阴离子交换②阳离子交换2009-11-20431.正相固相萃取分离：从非极性基体中萃取极性目标物。吸附剂（柱）：极性洗脱剂：用比样品极性更大的溶剂洗脱被吸附物。常用正相固相萃取柱①极性官能团键合硅胶LC-CN，LC-NH2，LC-Diol②极性吸附物质LC-Si，LC-Florisil，ENVI-Florisil，LC-Alumina2009-11-20442.反相固相萃取分离：从极性基体中萃取非极性样品吸附剂（柱）：非极性或较弱极性洗脱剂：用非极性溶剂解吸吸附在固定相中的目标物质。常用反相固相萃取柱LC-18、LC-8：标准的单键合硅胶ENVI-18、ENVI-8：聚合键合类填料ENVI-ChromP：苯乙烯：疏水ENVI-Carb：含碳2009-11-20453.离子交换固相萃取分离：带有电荷的化合物。吸附剂（柱）：带有电荷的离子交换树脂洗脱剂：常用高强度的缓冲液原理：目标化合物带电荷基团与吸附剂上的带电荷基团之间的相互作用是静电吸引力。2009-11-2046⑵阳离子交换LC-SCX：磺酸基；LC-WCX：羧酸基团常用离子交换固相萃取柱⑴阴离子交换LC-SAX、LC-NH2：脂肪族季铵类盐+硅胶2009-11-2047（三）操作程序柱管、烧结垫、固定相1.固相萃取柱的组成柱管筛板固定相2009-11-20482.装置2009-11-20493.固相萃取一般操作程序活化吸附剂上样冲洗洗脱2009-11-2050（四）选择分离模式和吸附剂1.目标物的性质和样品基体（即样品的溶剂）极性相似。目标物有无可能离子化。目标化合物有无可能与吸附剂形成共价键。杂质与目标化合物在吸附剂的吸附点上的竞争程度。2.样品溶剂的强度相对该吸附剂应该是较弱的，弱溶剂会增强目标化合物在吸附剂上的保留（吸附）。2009-11-2051（五）应用生物样本血样中药物及代谢物、尿液中微量毒物等生物大分子的纯化蛋白质、肽类等环境分析残留农药、空气中污染物等食品污染蔬菜、水果固相微萃取SolidphaseMicro-Extraction（SPME）•固相微萃取（SPME）分离法是20世纪90年代初发展起来的试样预分离富集方法，它集试样预处理和进样于一体，将试样纯化、富集后，可与各种分析方法相结合而特别适用于有机物的分析测定。•不是将待测物质全部分离出来，通过在样品与固相涂层间的平衡来达到分离。1.固相微萃取装置2.原理关键：石英纤维上涂吸附剂原则：目标化合物是非极性时选择非极性涂层；目标化合物是极性时选择极性涂层。萃取过程：石英纤维浸入样品中→目标化合物→扩散→吸附→平衡→取出石英纤维→洗脱→分析。3.特点•该技术具有简单、高效、灵敏度和精密度高的特点，集