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一、实验目的1、学习并掌握动物细胞培养的无菌操作技术。2、学习并掌握细胞传代培养的方法。3、学习并掌握用倒置荧光显微镜观察细胞细胞形态。二、实验原理细胞培养（cellculture）：细胞在体外条件下生长，细胞不再形成组织。动物细胞培养（animalcellculture）就是从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞（使用胰蛋白酶或胶原蛋白酶）然后，放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。由于细胞具有生长和自我复制的能力，为细胞体外培养和研究提供可能。动物细胞培养可分为原代培养和传代培养。原代培养（primaryculture）即直接从动物机体分离、获得组织细胞，在无菌条件下，用胰蛋白酶消化或机械分散等方法，将动物组织分散成单个细胞开始首次培养长出单层细胞的方法。传代培养（subculture）当细胞生长增值达到一定密度，用胰蛋白酶将细胞消化分散成单细胞，将细胞转移到新的培养皿中扩大培养的方法。高等生物是由多细胞构成的整体，在整体条件下要研究单个细胞或某一群细胞在体内的功能活动是十分困难的，但如果把或细胞拿到体外培养、增殖并进行观察和研究，则方便简单的多。被培养的动物细胞是非常好的实验对象和实验研究材料，对体外培养的活细胞进行研究可以帮助人类探索防治各种疾病途径和机制，也可以人为地诱导和改变细胞的遗传性状和特性，因此，动物细胞体外培养技术是研究细胞分子机制非常重要的实验手段，被广泛应用于医学、生物技术、基因工程等研究领域。三、细胞培养相关设施及材料1、细胞培养室无菌操作区：只限于细胞培养及其它无菌操作，与外界隔离。孵育区：培养箱设定的条件为37℃，5%CO2。制备区：培养液及有关培养用液体的制备，液体制备后应该在净化工作台进行过滤除菌。储藏区：包括冰箱、干燥箱、液氮罐等。清洗区和消毒灭菌区：清洗区为相对污染区，消毒灭菌区与清洗区分开。2、细胞培养常用基本设施：荧光显微镜、超净工作台、孵箱、电热鼓风干燥箱、冰箱、液氮罐、消毒器、恒温水浴槽、滤器等。细胞培养常用器皿：培养瓶、培养板、培养皿，玻璃瓶、吸管，离心管、冻存管，注射器，烧杯、量筒等。3、细胞培养用品的清洗、消毒新玻璃器皿要用5%稀盐酸浸泡，以中和其表面碱性物质：刷洗：硫酸清洁液浸泡：浓硫酸+重铬酸钾+蒸馏水；冲洗：流水冲洗15-20次，蒸馏水冲洗3次，三蒸水漂洗1-3次。所有需灭菌的器械、物品灭菌前均需包装，防止灭菌后污染。使用时放入超净工作台后打开包装。消毒灭菌：高压蒸汽灭菌（120℃，20min）；紫外线消毒：主要用于实验室房间空气及操作台。四、细胞培养用液及培养基1、培养用液：水（高度纯净）；缓冲液：平衡盐溶液，维持渗透压，调节PH值，供给细胞生存所需能量和无机离子成分；消化液：胰蛋白酶液，EDTA，胶原酶等。2、培养基：维持体外细胞培养生存和生长的溶液。（1）天然培养基：血清（胎牛血清、小牛血清、马血清、兔血清、人血清等）、血浆和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）水解乳蛋白；（2）合成培养基：根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成。如TC199、BME、MEM等。主要成分：氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其他一些辅助物质。五、动物细胞培养的条件（1）无菌、无毒的环境：对培养液和所有培养用具进行无菌处理，通常还要在培养液中加入一定量的的抗生素，以防被污染。此外应定期更换培养液，以便清除代谢产物防止细胞代谢产物累积对细胞自身产生危害。（2）营养物质：无机物（无机盐、微量元素等），有机物（糖、氨基酸、促生长因等）血清和血浆，但血清和血浆不是营养物质。（3）温度和PH：36.5±0.5℃，7.2-7.4。所需要的特殊条件：（4）血清：动物细胞离体培养常常需要血清。最常用的是小牛血清。血清提供生长必需因子，如激素、微量元素、矿物质和脂肪。在细胞培养中的主要功能：1)提供维持细胞指数生长的激素、基础培养基中没有或量很少的营养物以及主要的低分子营养物等；2)提供结合蛋白，能识别维生素、脂类、金属和其他激素等，能结合或调整改变它们所结合的物质活力；3)有些情况下其结合蛋白质能与有毒金属和热原质结合，起到解毒作用；4)新生牛血清是细胞贴壁、铺展在塑料、玻璃等培养基质上所需因子的来源；5)构成缓冲系统，调节酸碱平衡；6)提供蛋白酶抑制剂，在细胞传代时使剩余胰蛋白酶失活，保护细胞不受伤害；（5）支持物：大多数动物细胞有贴壁生长的习惯。离体培养常用玻璃、塑料等作为支持物。（6）气体交换：二氧化碳和氧气的比例要在细胞培养过程中不断进行调节，不断维持所需要的气体条件（95%的空气+5%的CO2混合气体），其中5%CO2气体是为保持培养液的PH稳定。六、实验内容1、用倒置荧光显微镜观察细胞形态2、动物细胞传代（1）培养皿中的细胞覆盖率达到80%-90%时要传代；（2）准备好所需材料，先将手及超净工作台用酒精消毒，点燃酒精灯，将滴管用火焰烧，将PBS、培养基、胰酶准备好，要避免滴管交叉污染；（3）将培养基喷酒精消毒，拿入超净工作台，用滴管把原有培养基吸掉；（4）加入PBS吹洗培养皿（由于培养基中血清对胰酶消化有抑制作用，所以先用PBS洗），不要使劲吹，细胞贴壁不好，然后吸出PBS；（5）加入适当的胰蛋白酶（使成单细胞悬液），消化30s，可快速在荧光显微镜下观察细胞形态，吸出胰酶；（6）加入含有血清的培养基终止胰酶消化，用滴管吹打细胞，让细胞悬浮起来；（7）根据细胞种类把细胞传到几个培养皿中，一般癌细胞分5个，正常细胞传3个，放入孵箱继续培养；（8）把超净工作台消毒收拾干净，将用过的滴管拿出超净工作台。七、实验数据及分析倒置荧光显微镜下HaCaT细胞形态倒置荧光显微镜下A375细胞形态HaCaT细胞为永生化人表皮细胞，来源于人皮肤，正常的细胞形态为上皮样，贴壁生。传代用胰酶消化时，先用胰酶润洗，吸出后，孵育5min。A375细胞为黑色素瘤细胞。胰酶消化时，在倒置荧光显微镜下可观察到细胞变圆变亮，不再贴壁，成为单细胞。八、实验注意事项1、实验进行前，无菌室及无菌操作台以紫外灯照射30-60分钟灭菌，以70%乙醇擦拭无菌操作台面，并开启无菌操作台风扇运转10分钟后，才开始实验操作。每次操作只处理一株细胞株，且即使培养基相同亦不共享培养基，以避免失误混淆或细胞间污染。实验完毕后，将实验物品带出工作台，以70%乙醇擦拭无菌操作台面。操作间隔应让无菌操作台运转10分钟以上后，再进行下一个细胞株的操作。2、无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如试管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暂时放置，其它实验用品用完即应移出，以利于气流之流通。验用品以70%乙醇擦拭后才带入无菌操作台内。实验操作应在抬面之中央无菌区域，勿在边缘之非无菌区域操作。3、小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，不要在打开的容器正上方操作实验。容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45°角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。4、实验人员应注意自身之安全，须穿戴实验衣及手套后才进行实验。操作过程中小心毒性药品，例如DMSO及TPA等，并避免尖锐针头之伤害等。5、定期检测下列项目：CO2钢瓶中CO2压力；CO2培养箱中CO2浓度、温度、及水盘是否有污染（水盘的水用无菌水，每周更换）；无菌操作台内之airflow压力，定期更换紫外线灯管及HEPA过滤膜，预滤网（300小时/预滤网，3000小时/HEPA）；定期更换水槽的水。