腐蚀生物膜垢中硫酸盐还原菌的系统进化分析

微生物学通报FEB20，2008，35(2)：161~165Microbiology©2008byInstituteofMicrobiology,[e-mail]*通讯作者：Tel:[phone];:[e-mail]收稿日期：2007-06-25;接受日期:2007-08-06研究报告腐蚀生物膜垢中硫酸盐还原菌的系统进化分析陈悟1,2汪文俊2向福2余龙江2*曾庆福1(1.武汉科技学院环科所武汉430073)(2.华中科技大学生命与科学技术学院武汉430074)摘要:从油田回注水系统加压泵后的管道管壁生物膜垢里分离得到的一株嗜热、嗜酸、异养型硫酸盐还原菌,编号为CW-04。该菌株兼性厌氧、革兰氏阳性、有极生鞭毛、直或弯曲的短杆状,能产孢子,最佳生长温度47℃,在20℃~63℃下培养基中均能使测试瓶有黑色沉淀产生。从腐蚀防治的角度研究该菌株的生长曲线。主要生理生化特性包括:生长pH范围为3.7~10,最佳生长pH为6~6.5,最佳生长盐度为0.7%。能够在H2+醋酸盐、甲酸盐、乙酸盐、丙酸盐、乳酸盐、丙酮酸盐和乙醇等电子供体中生长,也能够利用葡萄糖、果糖和简单的氨基酸作为唯一碳源生长;能够在硫酸钠、硫代硫酸钠、亚硫酸钠等电子受体中生长,但是不能利用硝酸盐和硫磺。通过16SrDNA测序以及系列比对分析:该菌属于细菌界(Bacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、梭菌纲(Clostridia)、梭菌目(Clostridiales)、蛋白胨链球菌科(Peptococcaceae)、脱硫肠状菌属(Desulfotomaculum),与该属中的种Desulfotomaculumaeronauticumd相似性达到99%。关键词:硫酸盐还原菌,脱硫肠状菌属,系统进化,16SrDNA,PCRLineagesEvolutionAnalysisofSulfate-reducingBacteriaintheCorrosionBiofilmCHENWu1,2WANGWen-Jun2XIANGFu2YULong-Jiang2*ZENGQing-Fu1(1.TheResearchCentreofEnvironmentalScience,WuhanUniversityofScience&Engineering,Wuhan430073)(2.SchoolofLifeScience&Technology,HuazhongUniversityofScience&Technology,Wuhan430074)Abstract:Anewthermophilic,acidityphilic,sulfate-reducingheterotrophicbacteria,strainCW-04,wasisolatedfrombiofilmdirtinessinpipelinewallafterpresspumpofaffusionsysteminoilfield.Thebac-teriumisanconcurrentlyanaerobic,non-motile,Gram-positive,poleflagellum,spore-formingcurvedrodgrowingwithinapHrangeof3.7~10(optimalgrowthatpH6~6.5)andtemperaturerangeof20℃~63℃(optimalgrowthat47℃),then,growthcurvewasstudiedtoefficientlypreventcorrosion.TheoptimumNaClconcentrationforgrowthis0.7%.Alimitednumberofcompoundsareutilizedaselectrondonors,in-cludingH2+acetate,formate,acetate,lactate,propionate,pyruvateandethanol.Sulfate,sulfiteandthiosul-fate,butnotsulferornitrate,canbeusedaselectronacceptors.StrainCW-04isabletoutilizeglucose,fructoseandsimpleaminophenolassourcesofcarbon.Analysisofthe16SrDNAsequenceallowedstrainCW-04(accessionnumbers:AY703033)tobeclassifiedasarepresentativeofanewstrainofthegenus162微生物学通报2008,Vol.35,No.2(Bacteria,Firmicutes,Clostridia,Clostridiales,Pep-tococcaceae)whosesimilarityis99%.Keywords:Sulfate-reducingbacteria,Desulfotomaculum,Lineagesevolution,16SrDNA,PCR原油在长时间的开采过程中,地层需要注水来维持油气输出压力,而输水所用的长金属管道管壁在水的生境中,极易形成由水体沉积物和微生物组成的生物膜垢[1,2]。人们通过对生物膜垢的形成[3]、结构[4]和微生物群落分析[5,6]得出:生物膜的形成是微生物腐蚀(MicrobiologicallyInfluencedCorrosionMIC)发生的必要条件,也是微生物的金属腐蚀难以防治的主要原因。本论文首次采用纯培养的方法直接从回注水系统的管壁膜垢中分离纯化得到一株耐温、嗜酸产孢子的脱硫肠状菌。从腐蚀防治的角度来研究它的生长代谢规律、生理生化特性,并通过对基因16SrDNA序列的测定进一步确定了该菌株的分类学和系统发育地位。1材料和方法1.1分离源和分离纯化方法菌株来自中石化中原油气高新股份有限公司文南油田联合污水处理站,菌株CW-04取自回注水系统加压泵后的碳钢管道管壁生物膜垢经富集、分离、纯化后得到。1.2菌株的形态学观察和芽孢观察菌体形态观察先用NikonAlphaphot-2YS2光学显微镜,后用JEM-100cxII透射电镜观察菌体形态、芽孢以及鞭毛情况,用扫描电子显微镜(SEM型号:HITACHI,X-650)观察菌体表面情况。并用革兰氏染色方法确定菌株是阳性还是阴性,培养芽孢用生孢培养基，鞭毛用磷钨酸负染的方法观察。1.3细菌生长量测定采用测定培养基中硫酸盐的消耗量来间接得到硫酸盐还原菌的生物量的变化的方法:420nm下进行比色测定,以硫酸盐为横坐标,OD值为纵坐标作出硫酸盐标准曲线,在曲线上得出培养液中的SO42浓度值。1.4生理生化实验实验利用已经使用过的北京华兴化学试剂厂生产的SRB-HX型硫酸盐还原菌测试瓶,将原菌体培养基抽空,加酸、洗净后,注入相应的不同碳源、硫的氧化酸盐、硝酸盐等硫酸盐还原菌培养基18mL,经湿法灭菌,接种2mL。在47℃培养箱中培养4d左右观察测试瓶溶液是否有黑色沉淀产生而最终确定菌株能否在这种特异培养基中生长。1.516SrDNA的PCR扩增和系列分析总DNA的提取按照文献[7]进行,PCR反应的引物参考文献[8],5'-端引物GM3:AGAGTTTGATC(A/C)TGGCTCAG(对应于大肠杆菌的8~24),3'-端引物U1492r:GGTTACCTTGTTACGACTT(对应大肠杆菌的1492~1510)。将所测系列通过Blast程序与GenBank中核酸数据进行系列比对分析,并利用T-COFFE进行多重序列比对、比对结果用MEGA3进行系统发育分析,构建系统进化树。2结果和分析2.1分离菌株形态学用接种针从油田新鲜废弃的腐蚀穿孔的金属碳钢钢管内壁刮去一层生物膜垢,直接接种到已灭菌的硫酸盐还原菌液态培养基中富集培养。用滚管法分离,得到一株兼性厌氧、直或弯的短杆状菌,用透射电镜和扫描电镜观察:直径为0.8m左右,长度3m~6m,有1~3根较长的端生鞭毛(图1-B是菌体喷金后的扫描电镜照片),可以观察到有明显的孢子生成(见图1-C),革兰氏染色阳性。在厌氧条件下如果接种到硫酸盐还原菌的琼脂培养皿中,可以观察到该菌落为气泡形,周围是黑色的硫化亚铁颗粒,顶端是鼓起的无色硫化氢气泡,直径0.5mm~2mm(见图1-A)。陈悟等:腐蚀生物膜垢中硫酸盐还原菌的系统进化分析163菌株的生长曲线的确定硫酸盐还原菌培养基中含有大量的硫酸根离子,SRB也是从硫酸根离子还原成负二价硫离子的过程中获得能量的;硫酸根离子消耗量的变化一定程度上反映了SRB数量的变化、代谢的快慢。采用在乙醇介质中,以钍试剂作指示剂,亚甲基蓝溶液作衬色剂,用铬酸钡标准溶液作滴定剂,可以合理测定硫酸根离子变化。而生长曲线的测定一方面可以提供不同菌株具有不同生长规律的信息,更重要的是可以指导我们合理的加药时间间隔、合理的加药方式以及合理的加药量(图2)。为我们最终解决油田回注水的微生物腐蚀问题提供了强而有力的理论依据。图1菌株CW-04的形态学(A:菌落形态照片;B:扫描电镜照片;C:孢子的透射电镜照片)Fig.1MorphologyofstrainCW-04(A:Photoofcellscolony;B:SEMofstrain;C:JEMofspore-form)表1菌株CW-04在不同电子供体下的生理特性(硫酸盐作为电子受体)Table1PhysiologicalcharacteristicsofCW-04specieselectrondonors(withsulfateaselectronacceptor)不同碳源DifferentcarbonsourcesDesulfoto-mauclumstrainCW-04不同碳源DifferentcarbonsourcesDesulfoto-MaculumstrainCW-04H2+CO2Isopropanol–H2+acetate+IsoamylalcoholSodiumFormate+Mannitol+SodiumAcetate+PropoctylalcoholSodiumLactate+propylthreealcoholSodiumPropionate+AetherSodiumButyrateAcetoneSodiumPyruvate+Glucose+SodiumCitrateFructoseSodiumSuccinateSaccharoseSodiumFumarateMaltoseSodiumMalateL-cystine+SodiumOxalateL-lysineMethanolD,L--amin-opropIonic+Ethanol+acidPropanolD,L-methionineButanolSodiumGlycolateElectronacceptors(withlactateasenergyandcarbonsource):Sulfate+NitrateSulfite+SulfurThiosulfate+2.3菌株的生理、生化特性研究2.3.1不同电子受体和电子供体对硫酸盐还原菌生长的影响:根据油田回注水系统中可能存在的有机碳源,结合实验室里的条件,我们研究了33种电子受体对硫酸盐还原菌生长的影响。同时,还研究了硫磺、硫酸钠、硫代硫酸钠、亚硫酸氢钠以及硝酸盐5种电子供体对SRB生长的影响,具体见表1。从表中我们可以看出:该菌株能利用一些初级醇类、短链脂肪酸、葡萄糖、一些氨基酸以及乙醚、丙酮等为碳源,较难利用分子