艾滋病与人类免疫缺损病毒的分子生物学

艾滋病与人类免疫缺损病毒的分子生物学Molecularbiologyofacquiredimmunodeficiencysyndromeandhumanimmunodeficiencyvirus第十四章内容•8.1概述•8.2HIV病毒的形态结构与传染•8.3HIV基因结构及编码的蛋白•8.4HIV的感染与复制•8.5HIV基因的表达调控•8.6病毒的致病机制•8.7病毒感染与机体免疫•8.8病毒感染的诊断•8.9艾滋病的治疗和预防８.１概述•HIV在病毒分类学上属逆转录病毒科（Retroviridae），慢病毒属中的灵长类免疫缺损病毒亚属，包括两种，即HIV-I和HIV-II。该病毒科中共有7属。•反转录病毒科的主要成员如下表1。表1８.２HIV病毒的形态结构与传染一、形态结构1、HIV结构(平面)图.12.HIV结构(立体)图.2传播途径：血液、血液制品以及人体分泌液，如奶液和精液等。传播对象：T淋巴细胞，也可以感染其他类型如B淋巴细胞和单形核细胞等。危害：HIV能够攻击人体的免疫系统，特别是能够侵入T细胞，使T细胞大量死亡，导致患者丧失一切免疫功能。二、病毒的传染８.３HIV基因结构及编码的蛋白一、基因结构HIV基因组由两条单链正链RNA组成，每个RNLA基因组约为9.7kb。在RNA5’端有一帽子结构(m7G5`GmpNp)，3’端有P0ly(A)尾巴。由结构上包括LTR，结构蛋白编码区（gag），蛋白酶编码区（pro），多种酶活性的蛋白编码区（pol），外膜蛋白（env）编码区以及6个调节基因。见(图3)、（图4）。图.3图.4HIV基因结构及编码的蛋白二、编码蛋白的功能1.gag基因:gag基因编码病毒的核心蛋白，翻译时先形成一个分子量大约是55kD的前体蛋日（p55），然后在HIV蛋白酶的作用下裂解成p17、p24、p15三个蛋白质。p24和p17分别参与构成HIV颗粒的内壳和内膜，p15进一步裂解成与病毒RNA结合的核壳蛋白p9和p7。2.pol基因:pol基因编码病毒复制所需的酶类，其中p66蛋白为逆转录酶，p32蛋白则为整合酶（integrase，INT）。3.pro基因:从pol和gag基因重叠区内起始的一段序列为pro基因，它编码蛋白酶p22，p22在裂解上述HIV蛋白前体形成终末成熟蛋白的过程中起着主要作用。4.env基因:env基因先编码出一个88kD的蛋白质，经糖基化后分子量增至160kD，这就是HIV包膜糖蛋白前体gP160。该前体蛋白在蛋白酶作用下被切割成gp120和gp41，gp120暴露于病毒包膜之外称外膜蛋白。８.４HIV的感染与复制图.5HIV的感染过程HIV的感染HIV感染细胞时可与细胞的CD4受体蛋白相结合；gp41称跨膜蛋白，是嵌入病毒包膜脂质中的部分。当gp120与CD4受体结合后，其构象改变导致与gP41分离，暴露出的gp41可插入细胞膜，造成膜融合，致使病毒核心被导入细胞。HIV与受体结合后，病毒核心进入细胞并在酶作用下脱去蛋白壳。RT以病毒RNA为模板合成单链DNA，随之经细胞的DNA聚合酶合成双链cDNA。cDNA经环化后整合到细胞染色体上，病毒核酸随细胞的分裂而传至子代细胞，十分稳定，可长期潜伏。原病毒整合到宿主染色体上,无症状;原病毒利用宿主细胞的转录和合成系统产生病毒mRNA,其中一部分编码病毒蛋白,与基因组RNA组装成新的病毒颗粒,从宿主细胞中释放出来侵染其他健康细胞;宿主细胞死亡.主要过程总结如下:８.５HIV基因的表达调控•LTR序列(1)核心调控元件(2)核心转录单位(3)反式作用因子应答元件•参与复制的调控蛋白(1)Tat蛋白(2)Rev蛋白(3)Nef蛋白(4)Vpr蛋白(5)Vpu蛋白(6)Vif蛋白一、LTR序列1.核心调控元件2.核心转录单位3.反式作用因子应答元件（见图6）调节单位核心单位TRA图.61.调节单位Coup-TFAP-1NF-ATUSFTCF-1аNF-κβ-453-78图.7Coup-TF-371-334鸡卵蛋白转录因子是coup-F家族中相对低分子量蛋白含有锌指环结构，起负调节作用AP-1激活蛋白1由含亮氨酸拉链结构的c-jun和c-Fos家族成员组成的二聚体，属于正调节因子-347-329NF-AT激活T细胞核因子（有两个结合位点）。-292-235-216-203USF上游激活因子含有螺旋-环-螺旋结构具有负调节作用-160-173TCF-1аT细胞因子1a含有高速泳动簇基序，起正调节作用-139-124NF-κβ核因子κβ含有锌指环结构及锚定蛋白重复序列，是增强子区。由3-4bp间隔的两个10bp（GGGACTTCCC）序列构成，负责调控HIV基因在多种细胞（尤其是T细胞）中高速表达。-104-782.核心单位-780SP1TATA图.8SP1Sp1含有与DNA结合的结构和两个富含谷氨酰胺的结构域。可形成二聚体或三聚体。当三个sp1分子与DNA结合后，改变了DNA的空间构型，激活HIV基因的转录。-78富含GC-46TATATATA元件两端有反向重复序列，可能是转录因子螺旋-环-螺旋DNA结合蛋白的识别位点。TATA元件上结合的是一组蛋白质，这些蛋白称为转录因子ⅡD（TFⅡD），也包括一些辅助激活蛋白（TBP）的细胞因子，这种作用是与RNA聚合酶相关，由此启动转录。-24-283.TRA图.9TRA(反式激活因子应答元件)似发夹结构，含有4个茎区和一个环区的稳定结构，此结构与tat蛋白结合有关。只有与tat蛋白共结合，才能转录出长mRNA，否则只能转录出小段的mRNA。二、参与HIV复制的调控蛋白1.Tat蛋白2.Rev蛋白3.Nef蛋白4.Vpr蛋白5.Vpu蛋白6.Vif蛋白（1）Tat蛋白的结构由tat基因编码，tat有两个外显子，前外显子编码67aa,后外显子编码34aa，共101aa。两个外显子所形成的肽共有6个结构区。前外显子有5个区，后外显子为一个区。见（图.10）1.Tat蛋白Tat蛋白有6个结构区，见下图，其中第一、第二和第四个三个结构区与反式激活功能有关。图.10Tat蛋白的结构示意图第1区为N区，也是酸性氨基酸区，因含有Gln和Asp对激活HIV-1基因的表达有增强作用。第2区为富含Cys区，在其16个aa中含有7个Cys,可以与二价金属离子形成tat二聚体，在7个Cys中有6个是维持tat活性所必需的。第4区为碱性区，有两个功能：48~52为GRKKR（甘-精-赖-赖-精）序列，是核仁定位信号，可介导自身或异种蛋白进入细胞核。该肽段可与TAR的RNA的凸起部分特异结合。（2）调控原理Tat与TAR是一个协同调解过程。TAR序列及完整的高级结构对调控的影响。若TAR序列发生突变，虽tat蛋白也能结合，但不能激活HIV表达。寄主因子协同作用的影响在不同的细胞中，tat的活性可有上千倍的差别，在人鼠杂交细胞中，只有在保持人第12号染色体的杂交瘤细胞中，tat才能有效地激活HIV-1的转录。说明其调控还需寄主细胞编码蛋白的协助作用。上游启动子和增强子对调控的影响当TAR远离启动子时，它的活性迅速下降。而且这种依赖作用对非激活和激活细胞并不一样，对激活细胞作用非常大，而NF-κβ的作用恰与上述依赖作用相反。Rev蛋白由两个外显子组成，分别编码一个25个氨基酸和91个氨基酸的肽段，这两个肽段最终组成一个116个氨基酸、其主要功能是促进HIV基因表达由早期（转录调节蛋白mRNA）向晚期（转录HIV结构蛋白mRNA）的转化，并促进晚期转录的进行。2.Rev蛋白Nef蛋白由Nef基因编码的，分子量为27kD，属于负调控蛋白和磷酸化蛋白，与细胞的膜结构相结合。Nef蛋白非HIV复制所必需，但可抑制HIVLTR特异性转录的HIV－1原病毒基因的表达。3.Nef蛋白Vpr蛋白由96个氨基酸构成，亦非HIV复制所必须，但存在于病毒颗粒中。含有vpr基因的HIV毒株与无vpr基因的HIV毒株比较，前者在细胞中生长较快，致细胞病变也较强于无vpr基因的天然株。4.Vpr蛋白Vpu蛋白是含81个氨基酸的磷酸化蛋白，为HIV－1特有，其功能可能是促进HIV－1颗粒的装配和从细胞膜释放，或抑制HIV－1颗粒从细胞内膜系统中芽生。5.Vpu蛋白Vif蛋白是分子量为23kD的病毒颗粒感染性因子，缺失Vif基因的HIV－1可在细胞内正常复制并产生病毒颗粒，但其比无Vif基因缺失的HIV-1产生的病毒颗粒的感染性低1000倍。6.Vif蛋白HIV复制与细胞表达图解RNARTcDNA(单链)DNA聚合酶环化细胞染色体切割酶切口切口p32DNA(双链)LTRSp1TATATARgagpolvprvpuenvnefLTRRevratvif指导调控基因表达(结构基因不表达)Tat蛋白tatRev蛋白nef蛋白Vpu蛋白Vpr蛋白Vif蛋白RevRev运入细胞质结构基因表达结构蛋白RNA组装新的HIV侵染转录mRNAmRNA迅速被切割运入细胞质转录不被切割８.６病毒的致病机制一、临床症状感染的急性期：HIV初次感染人体后，开始大量复制和扩散的过程，这时感染者血清出现HIV抗原，从外周血细胞、脑脊液和骨髓细胞也能分离到HIV。无症状潜伏期：约70％以上的原发感染者在感染后2～4周内出现急性感染症状，包括发热、咽炎、淋巴结肿大持续1～2周，此期感染者无任何临床症状，形同健康人，外周血中HIV抗原含量很低或检测不到。艾滋病相关综合症期：随感染时间的延长，HIV重新开始大量复制并造成免疫系统的进行性损伤。在临床上，病人感染逐步发展到持续性全身性淋巴腺病、艾滋病相关综合症（AIDS－relatedcomplex，ARC）。约有50％的感染者在感染后7～8年发展到艾滋病。产毒性HIV感染的最终结果是产生大量病毒颗粒，造成感染细胞死亡，这是逆转录病毒科慢病毒亚科病毒的特征。HIV除在细胞内大量繁殖造成细胞死亡外，还可经以下几种情况导致免疫功能下降：HIV颗粒表面的gp120蛋白脱落，与正常TH细胞膜上CD4受体结合，该细胞被免疫系统误认为是病毒感染细胞而遭杀灭。因TH细胞CD4受体被gpl20封闭，影响其免疫辅助切能。HIVgp120蛋白可刺激机体产生抗其CD4结合部位的抗独特型抗体，此抗体是抗CD4受体的抗自身抗体，可阻断TH细胞的功能。受染细胞表面带有病毒包膜蛋白gp120，可与其他CD4+细胞结合并形成巨细胞而失去功能，如此加速了HIV对免疫系统损害的范围和程度。二、病因：病毒的致病机制•超抗原（superantfeen）：超抗原可导致小鼠体内特定的T淋巴细胞亚群的消失和免疫缺损的发生。普通抗原需要经T淋巴细胞受体的α和β两条链的识别才能激活一细胞。体内有多种α链和β链，二者可任意配对，构成极为多样的受体组合和表面带该抗体的T淋巴细胞亚群，而超级抗原则与T淋巴细胞受体β链结合，导致所有带有此β链的T淋巴细胞亚群均被激活。而且与被普通抗原激活的结果不同，这些T淋巴细胞亚群不是产生了对抗原的免疫反应并分裂增生，而是丧失了对抗原的反应。并逐渐从免疫系统中消失。８.７病毒感染与机体免疫一、体液免疫HIV自然感染过程中，机体可产生高滴度的抗HIV多种蛋白质的抗体，包括中和抗体。中和抗体尽管有组特异性的，但主要是型特异性的。这些抗体有一定的保护作用，主要是在急性感染期降低血清中的病毒抗原量乃至清除病毒。二、细胞免疫HIV感染也刺激机体产生细胞免疫，包括依赖于抗体的细胞毒性（antibody－dePendentcellmediatedcytotoxicity，ADCC）、细胞毒性T淋巴细（cytotoxicTlymPhocyte，CTL）和自然杀伤细胞（naturalkillercell，NK）等。特异性细胞免疫反应，特别是CTL对于杀伤HIV感染的细胞和阻止HIV经细胞接触而扩散发挥重要作用，CTL可以帮助清除急性感染期多部位HIV感染灶和HIV感染早期的少量有HIV复制的细胞。８.８病毒感染的诊断艾滋病诊断就是要找出HIV感染的证据，即HIV抗原或抗