搜索
荧光实验技术及应用一基本概念二荧光参数三荧光仪器四仪器技术五实验考虑（影响荧光测量的因素）六荧光技术在生物学、医学研究中的应用荧光实验技术及应用一基本概念（一）引言1发光荧光磷光化学发光摩擦发光热致发光阴极发光电发光等等一基本概念2历史1852年Stokes阐明了荧光发射的机制。荧石（fluospar)1575：N.MonardesLignumNephriticum1880：Liebeman最早提出“荧光与化学结构关系”,的经验法则为荧光技术的开发应用拉开了序幕20世纪以来：对荧光进行了广泛而深入地研究紫外荧光，可见荧光，x光荧光，红外荧光（二）荧光的产生1分子的能量状态在光学分析中涉及的分子能量有：Eo=Ee+Ev+ErEe：价电子运动能,electronEv：原子在平衡位置附近的振动,vibrationEr：分子绕其重心的转动能,rotation其中，ΔEeΔEvΔEr每个分子具有一系列严格分立的能级。光是一种电磁波，光进入物质后发生两种情况1.能量几乎不被吸收2.能量被全部或部分吸收，光能被转移给分子。吸收具有高度专一性。2分子的能级EnergyLevels与跃迁Transition（三）荧光光谱光谱：玻尔兹曼分布（三）荧光与分子结构的关系11880年Liebeman最早提出了关于荧光与和化学结构关系的经验法则。2产生荧光的条件：A物质分子必须具有吸收的结构，即生色团B该分子必须具有一定的量子产率和适宜的环境。荧光团（1）碳原子骨架：分子具有共轭双键体系，大多含有芳香环或杂环任何有利于提高π电子共轭度的结构改变，都将提高荧光效率；或使荧光波长向长波方向移动。例如：对苯基化，间苯基化以及乙烯化等。3判断化合物能否发荧光，常从以下方面分析化合物荧光效率荧光波长联苯4-乙烯基联苯蒽9-乙烯基蒽0.180.610.360.76316333402432乙烯化作用对荧光效率以及荧光波长的影响（2）分子的几何排布：具有刚性平面结构COOCOOHHOHHCOCOOHHO荧光素酚酞（3）取代基的类型：A加强荧光的基团：给电子取代基-NH2,-NHR,-OH,-OR,-CN,-OCH3,-OC2H5B减弱荧光的基团：得电子取代基-CO2H,-COOH,-C=O,-NO2,-NO,-SH,-F,-Cl,-Br,-IC影响不明显的基团：-R,-SO3H,-NH3（4）取代基的位置：例如：邻位、对位—荧光增强，间位—荧光减弱（-CN基例外）（5）立体异构现象对于荧光强度有显著影响。例如：1，2-二苯乙烯的反式异构体有强荧光，顺式不发荧光（6）环境、溶剂、温度及pH等均会影响分子结构，从而影响荧光。例如：硫酸奎宁0.1N硫酸中发强荧光0.1N盐酸中无荧光（四）荧光分析的特点与常用的方法（1）灵敏度高荧光从入射光的直角方向检测，黑背景下检测荧光。普通光度术在入射光的直线方向检测，亮背景下检测暗线。（2）选择性强包括激发光谱和发射光谱两个谱。（3)样品量少和方法简便(4)能提供比较多的物理参数(5)对环境因素敏感，干扰因素较多1荧光分析的特点2荧光分析常用的方法（1)直接测定法：自荧光或内源荧光(2)间接测定法：外源荧光荧光探针探针与被研究分子的某一微区必须有特异性的结合，并且结合的比较牢固。探针的荧光必须对环境条件敏感结合的探针不应该影响被研究的大分子的结构和特性（３）利用淬灭和光化分解等现象，对一些物质进行定性与定量测量（４）荧光探针的应用分类测定细胞活性的荧光探针：活细胞探针和死细胞探针膜荧光探针：荧光基团标记的磷脂，阴离子膜探针，阳离子膜探针，其它非极性和双亲性膜探针。细胞器荧光探针：线粒体探针，溶酶体、酵母菌液泡和其它酸性细胞器的探针Ca2＋，Mg2＋，Zn2＋，Na＋，K＋，Cl－等离子荧光探针pH荧光探针:近中性pH应用的探针，酸性，探针交联物活性氧和一氧化氮探针信号转导探针：蛋白激酶，蛋白磷酸酶和核苷酸结合蛋白探针入胞作用、受体和离子通道探针pH细胞形态和流体测量的荧光示踪剂细胞骨架蛋白荧光探针二、荧光参数λex—Maximumexcitationwavelengthλem,λmax—Maximumemissionwavelength瑞利峰拉曼峰瑞利(Rayleigh)散射拉曼(Raman)散射荧光光谱与吸收光谱发射光谱的形状和激发光无关激发谱的形状和吸收谱形状极为相似发射谱性形状和吸收谱形状极为相似，且呈镜像对称关系。２斯托克斯位移(１)定义激发峰位和发射峰位的波长之间的差是一个表示分子发光特性的物理常数，这个常数被称为斯托克斯位移（Stokesshift).它表示分子在回到基态以前，在激发态寿命期间能量的消耗。3-羟基吡啶分子的种类正常阳离子激发态阳离子两性离子最适pH斯托克斯位移8N盐酸３N盐酸pH６5750983062403-羟基吡啶分子的斯托克斯位移斯托克斯位移＝107⎟⎠⎞⎜⎝⎛−emexλλ113荧光强度与总荧光量(１)荧光强度（fluorescenceintensity,F,I）与A荧光强度的定义：在一定激发波长(λex)作用下，发射的荧光强弱。F=IaφIa=I0-I，I=I010-εcLF=φI0(1-10-εcL){当C很低时F=φI0εcL，{当C较大时F=I0φBφ=发射光子数/吸收光子数量子产率（quantumyield,φ）荧光强度与浓度的关系内滤光效应：（2）总荧光量用荧光物质的发射谱面积来表示荧光的量，称为总荧光量。使用总荧光量来测定某物质含量，可以提高检测灵敏度。4荧光偏振(fluorescencepolarization)自然光部分偏振光偏振光I//-I⊥I//+I⊥P=I//-I⊥I//+2I⊥A=荧光偏振度Fluorescencepolarization--p荧光各向异性Fluorescenceanisotropy--A(1)荧光偏振度的物理意义：A：I//=I⊥，P=0，自然光，荧光分子运动很快，取向随机。（稀溶液）B：I//或I⊥为0，P=±1偏振光，荧光分子运动很慢，取向有序。C：I//≠I⊥≠0，0P1，生物大分子的荧光属于这种情况。(2)仪器校正因子G=IHV/IHHV(vertical）,H(horizontal)I//-GI⊥I//+GI⊥P=I//-GI⊥I//+2GI⊥A=(3)环境因素及分子运动对荧光偏振度的影响A：温度的影响温度升高，P降低B：溶液粘度粘度升高，P升高C：分子的运动—转动旋转弛豫时间rotationalrelaxationtime—ρτ05荧光寿命（Fluorescenceliftime--τ）（1）定义当去掉激发光以后，分子的荧光强度衰减为激发时最大荧光强度的1/e所需要的时间，常用τ来表示。I=I0e-kt,τ=1/k（2）影响因素分子所处的环境有无淬灭有无能量转移有无分子间相互作用（3）测量方法由于荧光寿命极短，所以测量与稳态荧光的测量不同，主要有以下三种方法：A脉冲法用一个极短时间（小于10-9S）的光脉冲激发荧光溶液，发射的荧光由快响应示波器接收。缺点：激发脉冲本身有一个衰减，所以用这种方法测量1毫秒级或更小的荧光寿命很困难。B位相调制法可精确的测定最小到0.3纳秒的荧光寿命。C偏振法本方法使间接方法，需要测定荧光偏振，极限荧光偏振以及旋转驰豫时间，然后根据Perrin公式进行计算。三荧光仪器吸收光谱仪光路图荧光光谱仪光路图（一）荧光仪器的基本结构1激发光源在紫外-可见光区，可供荧光激发用的光源很多包括：钨灯，碘钨灯，氢灯，氘灯，汞灯，氙灯等。主要根据光源稳定性和强度选择光源。实践中常不选用强光源：随着光强的增加，会同时导致散射光和热量的增多强光源照射，容易使样品产生光化分解强光源需要的稳压稳流装置复杂而昂贵产生大量臭氧，损害健康（1）钨灯和碘钨灯钨灯和碘钨灯在可见和近红外区发射连续光谱。因为很多荧光化合物需要250-400nm范围的波长激发，这两种光源对荧光测定不是十分有用。白炽灯的光谱能量分析（2）氢灯和氘灯氢灯和氘灯能在紫外区提供连续的光源。但是它们的能量比较小，所以在荧光分光光度计中很少使用。氢灯的能量分布氘灯的能量分布（3）汞灯汞灯发射强度大，稳定，并且不需要复杂的电源它给出的是不连续的光谱，常在滤片式荧光显微镜中使用。（4）氙灯氙灯能在紫外和可见区给出良好的连续光谱大多数荧光分光光度计采用，但需要严格的电源，以确保它的稳定性。氙灯（红线）和带有玻璃外套的汞灯的能量分布2单色器激发单色器发射单色器滤片式单色器光栅式单色器(1)滤片有色玻璃滤片、明胶滤片、液体滤光器和干涉滤片。中性滤片、截止滤片、带通滤片和干涉滤片。（2）光栅是荧光分光光度计的主要元件。它是在一个抛光的玻璃表面镀铝，然后在铝表面可大量的平行线制成。刻线数越多，分辨率越高。A优点在所有波长均有色散，且色散均匀，有相同的分辨率。入色光的大约80%能量是在一级光谱中。价格比棱镜便宜B缺点产生多极光谱，干扰分析。加入滤片来去除干扰。（3）狭缝狭缝越小单色性越好，但透过光强也随之减小。（4）样品池在可见可用玻璃池，但紫外区一定要用石英池。（二）仪器的维护1对于光源要注意以下几点（1）正负极不要接错。（2）拿灯时，不要碰窗口，以免手上的油污经紫外照射后，难以清除。应及时用无水乙醇擦干净。（3）灯有寿命，要节约使用。（4）启动间隔一般要大于半小时，待灯冷却后，在重新启动。启动后要预热半小时。（5）不要用眼睛直视灯。2单色器（1）不要轻易拆卸和触摸。（2）保持内部干燥。（3）选取波长时要按规定方向旋转。3比色池（1）设置空白对照。（2）清洗问题，关键是即时冲洗。自来水冲洗SDS浸泡双蒸水冲洗浓硝酸处理双蒸水冲洗四、仪器技术（一）灯电流不应超越最大允许范围（二）波长扫描范围已知样品不需进行广泛扫描未知样品，扫描激发和发射谱范围都要宽一些。（三）两个单色器的出射与入射狭缝宽度。（四）样品池的大小和位置提高电压可以提高灵敏度，但易疲劳，噪音增加同时会使温度升高造成灵敏度减低，及时降温（五）光电倍增管的电压（六）扫描速度扫描快会导致漏掉小峰，扫描慢则样品受光照时间长，易产生光化分解。五实验考虑（影响荧光测量的因素）（一）溶剂和化学试剂1溶剂选择要适宜例如：苯、丙酮、酚在紫外波段有吸收。2溶剂要纯（二）荧光污染1涂活塞用的润滑油以及橡皮塞和软木塞2去污剂3微生物污染4滤纸（三）稀溶液分析中的干扰1表面吸附：时间（分）015530回收率二氯乙烯庚烷不加乙醇加乙醇不加乙醇加乙醇1001001001009899949897817697100101104103溶质常被吸附在试管，吸管等管壁上。所用溶剂极性越小，吸附就越大。2氧化储存液应配制成较高浓度，工作液要新鲜配制。微量氧化剂包括氧的存在，会减弱化合物的荧光。3光化分解（photodissociation）光照后导致化学键断裂——荧光减弱荧光物质要避光保存（四）内滤光效应和自吸收现象1内滤光效应溶液中若存在能吸收激发或荧光物质所发射的光能的物质，就会减少观察到的荧光，这种现象称为内滤光效应。2自吸收现象内滤光效应的另一种情况是有时物质本身的吸收和发射光谱有重叠所以在溶液较浓的时候，一部分荧光发射在它离开吸收池之前就又被吸收。荧光强度与浓度的关系（五）温度对荧光的影响在一定温度范围内，随着温度升高荧光强度降低。温度每升高10C，荧光减少的百分比，称为温度系数。在20-300C的范围内，温度系数大约为1.5。（六）溶液pH的影响利用一些物质在不同pH值溶液中荧光强度和颜色的改变，可以判别各种滴定的终点。指示剂颜色变化pH范围萘酚无色变黄绿8.2-10.3荧光素浅绿变绿4.0-5.0丫啶橙浅黄绿变黄8.0-10.0（七）溶液极性的影响荧光物质在非极性溶液中的发射峰位比其在极性溶液中的峰位向短波方向（或高频方向）移动，即蓝移，同时荧光强度前者也高于后者。DPH水溶液中膜中激发波长：440nm激发波长：430nm（八）溶液粘度的影响溶剂粘度对TNS荧光强度的影响（八）淬灭(quenching)1碰撞淬灭荧光物质分子与淬灭分子碰撞，前者损失