荧光化学发光在植物分子生物学的应用

荧光/化学发光在植物分子生物学的应用陈海旭博士Outline1、荧光技术2、化学发光技术1、荧光技术荧光技术的分类1)荧光强度2)时间分辨荧光3)荧光偏振4)荧光共振能量传递5)均相时间分辨荧光1）荧光强度（FI）S1innerorbitalouterorbitalnucleousExcitationSignalExEmSoEmissionSignalFI应用的优势灵敏度高，使用方便、安全可以灵活地利用各种类型的荧光探针和荧光染料对目标物质进行特异性标记，大大减少杂质的信号干扰可以进行活细胞或活体检测（细胞毒性小）可以进行多重专一性标记（如蓝色细胞核/红色线粒体）FI应用范围生物大分子的定量分析核酸、蛋白质酶活性分析糖甘酶、蛋白酶、脱氢酶、过氧化物酶钙流检测报告基因检测（GFP）FI应用－核酸定量分析Picogreen荧光染料可以排除蛋白质等的信号干扰（用于检测蛋白质样品中的微量核酸）•ArabidopsisChromatinDNA－ThePlantCell,1846–1858,2003(15)•TobaccoRNA－ThePlantCell,2203–2217,2003(15)FI应用－糖苷酶活性分析b-D-glucosidase－4-MUb-D-glucopyranosideb-D-fucosidase－4-MUb-D-fucosideDecreasedGlucosidaseandFucosidaseActivityinnai1-1andnai1-2ArabidopsisMutants.(PlantCell,1536–1549,2004-16)FI应用－蛋白酶活性分析FractionationofSoybeanProteasesafterOxidativeStress.(H2O2treatedvs.control)(PlantCell,431–443,1999-11)Arginine-specificProtease－Z-Gly-Gly-Arg-AMCFI应用的局限性背景荧光干扰微孔板的自发荧光细胞的内源荧光2）时间分辨荧光（TRF）ElapsedTimeIntensityExcitationAutoFluorescenceFluoresceinEmissionEuropiumEmissionLongDecayTime...------Measurement------利用时间特性达到超高灵敏度Europiumion镧系元素镧系元素螯合物时间分辨荧光素－镧系元素螯合物孵育(结合)洗涤（去除非结合）检测缺点：需洗涤；洗涤强度很难一致，结果重复性差。FI/TRF应用的局限性（非均相技术）荧光偏振（FP）荧光共振能量转移（FRET）均相时间分辨荧光（HTRF）均相技术的优势孵育(结合)检测优点：无需洗涤；均一性、重复性好“Add,Mix,andRead”3）荧光偏振（FP）PolarizerAnalyzer偏振光荧光分子运动荧光分子静止100%0%荧光偏振（FP）原理100%0%荧光偏振是一种测量分子旋转速率的技术。P=————I||+I|_I||–I|_标记的配体(低偏振值）目标分子与标记的配体结合（高偏振值）FP应用方式－偏振值与分子大小的关系FP应用的优势均相(无分离/洗涤），在溶液中测量；可以实时检测（动力学检测）；快速，容易实现高通量测量的是比值，结果与荧光基团的绝对浓度无关FP应用范围受体－配体相互作用多肽－蛋白质结合蛋白质—核酸结合酶活性分析淀粉酶、蛋白酶、磷酸激酶、磷酸酶fragmentsAmylaseAmyloseFP应用－淀粉酶活性分析荧光标记的Amylose被分解成小片段(偏振值下降)淀粉酶会促进生物体内淀粉粒的降解，进而产生更多的能量物质，来响应某些环境刺激或促进种子萌发。FP应用的局限性使用具有较短寿命的荧光素（如Fluorescein）依赖于分子结合造成的分子体积的显著改变LARGEmolecule4）荧光共振能量传递（FRET）BindingNOBinding均相检测（无分离和洗涤步骤）实时连续地观察活细胞的动态变化FRET应用的优势FRET应用范围酶活性分析蛋白酶、磷酸激酶蛋白质—核酸相互作用酵母双杂交系统、噬菌体展示系统所筛选克隆的复证钙流检测、离子通道研究蛋白质的结构研究FRET应用－钙流检测以荧光蛋白为基础的Ca2+sensor供体：CFP受体：YFPGuardcell（Arabidopsis）胞浆钙离子动态(PlantJ,1999-19,p735-747)FRET应用示例－钙流检测FRET应用－胞内激酶活性分析Indicatorsforproteinphosphorylationinlivingcells1)已知蛋白激酶特异性的底物结构域2)磷酸化识别结构域蛋白质磷酸化是信号转导过程中的重要标志FRET应用的局限性信噪比经常不佳，通常为1：1---背景主要来自受体被直接激发的信号供体：镧系元素螯合物受体：XL6655）均相时间分辨荧光（HTRF）PAPCExcitationat320nmEmissionat665nmTimeIntensityHTRF应用的优势－灵敏度更高的FRETPYenergytransferAPCEuExcitationat320nmEmissionat665nmTimeIntensity2、化学发光技术化学发光技术的分类1)发光2)发光共振能量传递1）发光（Lum）SubstrateProduct+LightEnzyme优势：超高灵敏度Lum应用范围钙流检测基因调控ATP检测发光免疫分析发光应用－钙流检测水母发光蛋白AequorinCa++Kineticsoftheβ-glucan（葡聚糖）elicitor-inducedenhancementofthe[Ca2+]cytinsoybeancells.（BiologicalProceduresOnline2002-4/1,p105-118）发光应用示例－钙流检测发光应用－基因调控pSP-luc+(转化拟南芥细胞)Culturedcellsshowdiurnalrhythms(Arabidopsis)(PlantCellPhysiol,2004-45/1,p57-67)CCA1的启动子区域CCA1－在昼夜节律调节起中心作用的转录因子发光应用示例－基因调控2）发光共振能量传递（BRET）•Donor=Renillaluciferase(Rluc)•Acceptor=YFPBRET应用范围蛋白组学:蛋白-蛋白相互作用胞内细胞器间的相互作用对酵母双杂交结果的验证受体研究:受体的同源和异源二聚体化受体应答传导途径孤儿受体的筛选BRET应用示例－蛋白质相互作用发光光谱（关注530/480ratio）COP1的二聚体化COP1-光形态建成的关键抑制因子COP1蛋白突变体的二聚体化研究(PNAS,2004-101/17,p6798–6802)BRET应用示例－蛋白质相互作用cytoplasmiclocalizationsignal(CLS)技术总结荧光技术利用荧光物质进行特异性标记；特异性好，灵敏度高；特别适合于细胞研究和分子间相互作用研究。发光技术灵敏度超高，特别适合于基因表达和基因调控研究。Tecan多功能酶标仪家族针对各种光检测技术的TotalSolution通用型检测系统功能全面的滤光片型检测系统独一无二的全光谱扫描型检测系统多功能酶标仪支持的微孔板类型从6孔-48孔的细胞培养板、96孔酶标板到384、1536板等高密度筛选板谢谢大家！[e-mail]