菊花的组织培养与快繁技术研究生物技术及应用

1江苏农林职业技术学院毕业设计（论文）SNL/QR7.5.4-3菊花的组织培养与快繁技术研究专业生物技术及应用学生姓名程强班级06生物技术（2）学号061401229指导教师宋刚完成日期2009年4月25日江苏农林职业技术学院毕业论文（设计）2成绩评议学号061401229姓名程强题目菊花的组织培养与快繁技术研究指导教师建议成绩：评阅教师建议成绩：答辩小组建议成绩：院答辩委员会评阅意见及评定成绩：答辩委员会主任签字（盖章）：年月日附2：3毕业设计（论文）任务书姓名程强学号061401229班级06生物技术（2）班题目菊花的组织培养与快繁技术研究设计(论文)主要内容通过通过对不同外植体需要不同的条件以及培养过程中激素的种类及浓度大小对诱导侧芽生长、继代增殖和诱导生根的影响的研究，选出一系列对菊花组织培养成功出苗最有利的条件。重点研究问题1、菊花的取材部分及大小对诱导侧芽的影响2、在诱导实验中，激素（6-BA、NAA）浓度对诱导率的影响3、诱导侧芽时Vc溶液对褐变的影响4、继代增殖时期的选择主要技术指标1、整个研究过程中污染率不超过10%。2、侧芽诱导率不低于80%。其它要说明的问题指导老师意见指导教师签字：年月日江苏农林职业技术学院毕业论文（设计）4指导教师意见对论文的简短评价：1.指出论文存在的问题及错误2.对创造性工作评价3.建议成绩优良中及格不及格指导教师签字年月日评阅教师意见对论文的简短评价：1.指出论文存在的问题及错误2.对创造性工作评价3.建议成绩优良中及格不及格评阅教师签字年月日附4：5答辩小组评议意见学号061401229姓名程强题目菊花的组织培养与快繁技术的研究答辩小组意见：1、对论文的评价2.建议成绩等级优良中及格不及格3.需要说明的问题答辩小组长签字年月日江苏农林职业技术学院毕业论文（设计）6摘要：以带有腋芽的菊花嫩茎为外植体，接种在丛生芽诱导培养基上（MS+6-BA3.0mg/l+NAA0.5mg/l），15天左右诱导成芽，在将芽接种于继代培养基中（MS+6-BA3.5mg/l+NAA0.5mg/l）进行继代培养，一般30天后能长成高达2cm的小苗丛。最后接种于生根培养基中（MS+IBA0.5mg/l），7天左右即可生根，20～25天后生根达100%。将生根试管苗开盖练苗，移栽，成活率达95%以上。关键词：菊花；组织培养；快速繁殖Abstract：Withaxillarybudsofchrysanthemumtotenderstemexplantsforinoculationinthemultipleshootclumpsinductionmedium(MS+6-BA3.0mg/l+NAA0.5mg/l),15daysinducedbud,inthebudinoculationinthesubculturemedium(MS+6-BA3.5mg/l+NAA0.5mg/l)forsubculture,andfinallyinoculatedintotherootingmedium(MS+IBA0.5mg/l),aboutsevendaystoroot,20to25daysonaveragerootingratewas100%.Openingswillbepracticedinvitrorootingofseedlings,transplanting,thesurvivalrateofover95%.Keywords：Chrysanthemum;Tissueculture;RapidPropagation江苏农林职业技术学院毕业设计（论文）7目录引言…………………………………………………………………………………11材料和方法………………………………………………………………………11.1材料与用具……………………………………………………………………11.1.1材料……………………………………………………………………………11.1.2器材与用具…………………………………………………………………11.1.3药品与试剂……………………………………………………………………11.2培养基的配制……………………………………………………………………11.3取材和消毒………………………………………………………………………21.4诱导侧芽生长……………………………………………………………………21.5继代培养……………………………………………………………………21.6诱导生根…………………………………………………………………………21.7移栽培养…………………………………………………………………………22结果与分析…………………………………………………………………………32.1处理对外植体褐化的影响………………………………………………………32.2不同接种方式丛生芽的增殖……………………………………………………33小结…………………………………………………………………………………4参考文献…………………………………………………………………………5致谢…………………………………………………………………………………6程强：菊花的组织培养与快繁技术研究1引言菊花是多年生宿根草本植物，原产我国，栽培历史悠久，以其多姿多彩的形态、迷人的芳香，深受人们喜爱，现已成为世界性栽培面积较大的重要花卉。其品种多达约25000种，我国的菊花品种也有7000种以上，是人们非常喜欢的一种常见花卉。目前菊花最主要的功能就是用于园林的绿化和观赏。其次，菊花能够保护环境、净化空气，另外，菊花还具有清热解毒功能，可作饮料和药物[1，2]。现在生产上多用扦插和嫁接繁殖，但该方法大面积绿化使用时成苗慢，尤其在北方地区冬季严寒，夏秋季节为主要绿化季节，冬春季节为育苗季节，相对来说任务重，成本高。随着组培技术的发展，其快速、高效、保优等都将改变这种不足[3]。组织培养条件可控不受季节限制，可全年连续生产，能以28天左右增殖5—7倍的速度在组培室内繁殖菊花小苗，比传统方法要快得多。而且能获得大量规格统一的菊花苗。菊花的多数器官都可以进行组织培养。而国内外大多数报导，菊花快繁是采用茎尖和叶片，通过产生愈伤组织诱导分化出芽，但所生产的植株易突变，不利于生产。组织培养方法不仅繁殖系数高、繁殖速度快，而且还可以进行品种的脱毒复壮、种质资源保存等。为了在短时间内快速繁殖而获得良种种质的幼苗，我采用组织培养法进行了试管快速繁殖试验，采用茎切断通过激素处理，使腋芽直接分化成侧芽形成丛生芽，而不经愈伤组织，然后将丛生芽进行快繁、生根，即可获得大量整齐一致的壮苗，为菊花优良品种苗快速繁殖打下了基础[4]。1材料和方法1.1材料与用具1.1.1材料菊花嫩茎1.1.2器材与用具超净工作台、剪刀、长柄镊子、架台、无菌滤纸、酒精灯、火柴、标签、铅笔、棉球、废液缸、垃圾袋、皮筋、精密pH试纸5.4—7.0、玻璃三角瓶(150ml)、封口膜、培养皿。1.1.3药品与试剂MS培养基母液、激素（生长素、细胞分裂素等）母液、有机物（琼脂、蔗糖）、无菌水、0.1%升汞、75%酒精、0.1MNaOH。1.2培养基的配制选用MS为基本培养基。在培养物的不同发育阶段分别添加不同种类和浓度的植物激素，蔗糖3.0%，pH5.8～6.0，用约0.8%的琼脂固化，分装后在121℃条件下灭菌20min，放置备用。其中，丛生芽诱导培养基为MS+6-BA3.0mg/l+NAA0.5mg/l；继代培养基为MS+6-BA3.5mg/l+NAA0.5mg/l；生根培养基为MS+IBA0.5mg/l。江苏农林职业技术学院毕业论文（设计）23取材和消毒取生长健壮的菊花嫩茎用自来水洗去表面泥土。在超净工作台上，用70%酒精处理20～30秒，再用无菌水冲洗3～5次，转入0.1%升汞溶液中浸泡8～10分钟，再用无菌水冲洗4～6次，用时用滤纸吸干水分，放在超净工作台上待用[5]。操作之前操作者要用肥皂清洗双手，擦干，再用酒精棉擦拭双手。1.4诱导侧芽生长在无菌条件下将其切成2厘米左右带有腋芽的小段，用镊子夹取切好的外植体材料，按极性方向直立迅速接种到三角瓶的培养基中，深约2～3mm。每个三角瓶中可接3个。为防止其褐化，接种前将一半的外植体放在1%的Vc溶液中浸泡5分钟，再接种于诱导培养基上。接种时三角瓶应保持倾斜，接种后要迅速将瓶口在酒精灯上转动灼烧一遍进行消毒，然后迅速盖好封口膜。最后在瓶壁上贴上标签，注明接种材料的名称、编号和接种日期。接种完成后转入培养室进行初代培养，培养温度22～28℃，光照强度为1000～4000Lx[6]。经过7天左右，茎段开始变粗，并在其切口周围出现少量嫩绿色、质地紧密的愈伤组织，同时腋芽开始萌动展开。经过10～15天的培养后，腋芽伸长，并形成丛生芽，逐渐长成苗丛。1.5继代培养当丛生芽有逐渐长成苗趋势时，可及时进行继代增殖。在无菌滤纸上，将丛生芽切割成几块，分别接种于继代培养基上，每瓶2～3个芽，一般30天后可长成高达2cm的小苗丛，取丛生芽转接于新的继代培养基上，则可在更短的时间内长成丛生芽，继代培养的次数越多，从接种到长出丛生芽所需的时间越短[7]，但不短于7天，若不及时转接，芽苗会迅速长高。1.6诱导生根当继代培养的丛生芽长至2～3cm，具有2～3片叶时，可将其切成单株,转接到生根培养基中进行培养，一般1周后有根出现。1.7移栽培养当试管苗在生根培养基长至5cm左右时，先将封口膜打开，让其由无菌环境转至有菌且湿度较低的环境之中约3d，然后将苗取出，小心用流水洗去根表面的培养基残留物，移栽到蛭石中，适当遮荫，一星期后即可成活，成活率达95%以上，一个月后即可上盆[8]。2结果与分析2.1处理对外植体褐化的影响通过近30天的目测观察统计，供试外植体材料表现如下（表1）。结果表明：未用0.1%Vc溶液处理的外植体茎段轻微发褐，茎段顶端长出毛状菌丝或培养基表面有孢子状的菌斑和程强：菊花的组织培养与快繁技术研究3菌落，长出的芽苗不旺盛，茎段组织易发生褐化现象，其褐化率为41.6%；用0.1%Vc溶液处理的外植体茎段保持绿色，培养基不易污染，长出健壮的芽苗，是因为Vc具有还原性,它可以抑制外植体内的多酚氧化酶被激活，预防醌类物质的形成[9]，可明显降低褐化率为11.6%。表1：不同处理外植体培养30天后生长、分化统计表时间外植体变化情况未用0.1%Vc溶液浸泡用0.1%Vc溶液浸泡10d内培养基污染,茎段组织褐变而死掉茎段保持绿色10-20d茎段轻微发褐，顶端长出毛状菌丝或培养基表面有孢子状的菌斑和菌落腋芽开始萌动展开，有的出现了愈伤组织20-30d茎段长出了绿色的小叶子腋芽伸长，出现了丛生芽表2不同处理外植体褐化情况统计外植体处理接种瓶数褐化数褐化率10.3011.1011.1811.2510.3011.1011.1811.250.1%Vc浸泡15151515022311.6%0.1%不用Vc浸泡15151515749541.6%2.2不同接种方式丛生芽的增殖在继代过程中发现切取的继代苗只留一个芽苗与留2个芽苗培养对增殖率有影响。单芽接种通常是继续长高变壮，增殖倍数较低，平均增值倍数为3.11，而2个芽苗接种培养则先形成大量紧凑的丛生芽，再继续长高，增殖倍数较高，平均增值倍数为6.94。除此之外，同在一种培养基上，一芽苗的生长速度比2芽苗的还表现的慢，所以从本实验能看出，菊花快繁在大规模继代增殖时，最好采取每瓶接种2个芽苗的方式进行增殖。表3继代时不同芽苗数的增殖情况继代甁数每瓶芽数增殖总芽数平均丛生数平均增殖数增殖时间（d）181563.113.11301821256.946.94253小结一般在添加生长素和细胞分裂素的培养基中提高细胞分裂素的质量浓度，有利于芽的诱导形成；提高生长素的质量浓度，有利于根的形成；两者处于一定平衡质量浓度时，则有利于愈伤组织的形成[10]。本实验中用的丛生芽诱导培养基为MS+6-BA3.0mg/l+NAA江苏农林职业技术学院毕业论文（设计）40.5mg/l，试验结果表明