菹草类胡萝卜素的结构鉴定、分类及生物活性研究

华中农业大学博士学位论文菹草类胡萝卜素的结构鉴定、分类及生物活性研究姓名：任丹丹申请学位级别：博士专业：食品科学指导教师：张声华20061001菹草类胡萝卜素的结构鉴定、分类及生物活性研究作者：任丹丹学位授予单位：华中农业大学相似文献(10条)1.期刊论文王海滨.彭光华.刘良忠.刘民.任丹丹.石嘉怿.张声华菹草类胡萝卜素的研究--菹草与红心鸭蛋类胡萝卜素特性的初步比较-食品科学2003,24(11)用菹草喂养蛋鸭能生产优质红心蛋,通过薄层层析及紫外可见吸收光谱等研究,发现菹草含有一类特殊的红色类胡萝卜素,菹草红色类胡萝卜素及部分黄色类胡萝卜素与红心蛋色素有很好的对应关系,证明了红心鸭蛋的红色素来源于菹草;菹草红色类胡萝卜素易溶于丙酮、乙醇、甲醇等极性溶剂,其丙酮溶液的可见吸收光谱峰波长为480nm;菹草和红心鸭蛋中都含有β-胡萝卜素;对菹草类胡萝卜素的部分特性作了初步研究.2.期刊论文任丹丹.彭光华.王海滨.张声华.RENDan-dan.PENGGuang-hua.WANGHai-bin.ZHANGSheng-hua菹草类胡萝卜素体外抗氧化活性的研究-食品科学2005,26(3)菹草类胡萝卜素是红心鸭蛋中红色素的天然来源.本文用D-脱氧核糖法研究菹草类胡萝卜素清除·OH的效果,用硫代巴比妥酸法测定小鼠肝组织及肝线粒体中丙二醛含量,用分光光度法测定小鼠红细胞溶血和肝线粒体肿胀程度,从而研究类胡萝卜素的抗氧化效果.结果表明:菹草类胡萝卜素可以清除·OH,抑制·OH所致丙二醛的产生,减少红细胞溶血,减轻肝线粒体肿胀程度.可以得出菹草类胡萝卜素具有明显的抗氧化的作用.3.学位论文王海滨菹草红色类胡萝卜素的结构表征及其抽提物生理活性研究2005菹草(PotamogetoncrispusL.)是眼子菜科沉水维管束植物，广泛分布于湖泊、水库和沟渠等地，湖区的蛋鸭采食菹草后能生产优质的红心鸭蛋，但其原因一直不明。而且鲜菹草生长的季节性很强，因而红心蛋的生产受到很大限制。国内外大量研究表明，蛋黄色泽与饲料中类胡萝卜素的种类和含量密切相关。类胡萝卜素不仅是重要的天然色素，而且具有抗氧化、免疫调节、抑制肿瘤细胞生长等生物活性。本实验室的初步研究表明：这种红心蛋的类胡萝卜素提取物可显著抑制肿瘤细胞S180的生长，因此对菹草类胡萝卜素进行深入系统的研究具有重要意义。本课题综合运用了化学分析、色谱、光谱及质谱等现代仪器分析技术和方法，将菹草和红心鸭蛋中的类胡萝卜素进行了对比研究，确定了菹草中特殊红色类胡萝卜素的化学结构；采用细胞分子生物学前沿技术和手段，探讨了菹草类胡萝卜素抽提物对人肝癌细胞株QGY-7703生长抑制和对癌细胞凋亡的影响；运用食品及饲料加工新技术，研制开发了红心蛋专用菹草功能颗粒饲料。本研究为深度开发利用菹草资源、实现菹草颗粒饲料及红心蛋功能产品的产业化奠定了坚实基础。主要研究内容及成果如下：1对菹草和红心鸭蛋蛋黄类胡萝卜素的特性进行了初步比较研究，建立了菹草红色类胡萝卜素的分离、纯化和制备方法1.1用有机溶剂浸提冻干菹草类胡萝卜素的最佳参数条件是：浸提液为石油醚－丙酮(1：3，v/v)混合溶剂，料液比为90(mL/g)，在常温下分3次浸提，总浸提时间为1.5h。冻干菹草粉总类胡萝卜素的含量为552.57mg/kg，在此条件下其总类胡萝卜素的提取率可达95.5％。1.2菹草中的红色类胡萝卜素和部分黄色类胡萝卜素与采食菹草的蛋鸭所产红心蛋蛋黄色素有很好的对应关系，此红心鸭蛋的红色类胡萝卜素来源于菹草。1.3采用氧化镁-硅藻土(1：2，w/w)柱层析、硅胶G薄层层析可从菹草总类胡萝卜素中分离纯化得到3个红色类胡萝卜素组分r1、r2和r3，其Rr分别为0.32、0.34和0.38；薄层层析展开剂为正己烷-乙酸乙酯-丙酮-甲醇=27：4：2：2(v/v/v/v)。2对菹草红色类胡萝卜素r1、r2和r3的化学结构进行了表征用紫外可见吸收光谱、红外光谱、拉曼光谱、高效液相色谱-电喷雾质谱联用分析、低分辨和高分辨电子轰击质谱及其它理化分析研究了菹草红色类胡萝卜素r1、r2和r3的化学特性和结构，主要结论是：2.1r1、r2和r3在丙酮、甲醇、乙醇、氯仿、二硫化碳中的紫外可见吸收光谱均为比较平滑对称的单峰(对应的最大吸收波长为λmax)，在正己烷中则呈现不对称“三指状”谱峰的趋势，与正己烷相比，随溶剂极性增强，λmax增大；从总体平均趋势看：r1、r2和r3的λmax依次减小(蓝移)几个nm。r1、r2和r3的红外光谱表明它们是含羰基多烯化合物，其拉曼光谱特性表明它们均具有类胡萝卜素的基本碳架结构，其测试反应表明它们的分子中含羰基，而不含5，6或5，8-环氧基团。结果充分证明：r1、r2和r3是含有共轭多烯链和羰基的类胡萝卜素化合物，与虾青素、角黄素和β-胡萝卜素结构不同，且r1、r2和r3之间的细微结构不同。2.2经高效液相色谱-电喷雾质谱联用和低分辨电子轰击质谱分析得到r1、r2和r3的相对分子质量均为562；经高分辨电子轰击质谱分析得到r1、r2和r3的精确相对分子质量分别为562.38164、562.38146和562.38002。综合分析表明：r1、r2和r3的元素组成相同40C：50H：20，即它们的分子式均为C40H50O2、相对分子质量均为562。2.3将r1、r2和r3与从紫杉浆果中分离纯化的红色素Tr1、Tr2和Tr3进行了薄层层析、紫外可见光谱和质谱分析，结果表明：r1、r2及r3和Tr1、Tr2及Tr3是完全对应的化合物。根据以上研究结果，综合分析确认：菹草红色类胡萝卜素r1、r2和r3三者分子式均为C40H50O2、相对分子质量均为562，而且都是含有羰基的类胡萝卜素，它们与紫杉紫素(Rhodoxanthin)具有相同的基本结构，是紫杉紫素的同分异构体(顺反异构体)；根据波谱分析，初步推测r1可能是全反式异构体，而r2和r3可能是顺式异构体。3探讨了菹草类胡萝卜素抽提物(CEPC)对人肝癌细胞株QGY-7703生长抑制和癌细胞凋亡的影响以人肝癌细胞株QGY-7703为材料，采用细胞培养为基本方法，分别用含10、20、40和60μmol/L的CEPC培养液对QGY-7703细胞进行了处理。用MTT法检测细胞存活率，用可见光显微镜、荧光显微镜和激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)观察细胞形态的变化，用LSCM观测细胞内钙离子浓度的变化，用流式细胞仪检测细胞周期变化等综合手段，研究了菹草类胡萝卜素抽提物(CEPC)对人肝癌细胞生长抑制和癌细胞凋亡的影响。由实验得到的结论是：CEPC对QGY-7703细胞的生长具有明显的抑制作用，且在一定程度上呈时间-效应和剂量-效应依赖关系。在较短的时间内(48h)及使用较小的CEPC剂量(10μmol/L和20μmol/L)就能有效地诱导QGY-7703细胞凋亡，CEPC使QGY-7703细胞周期阻滞于G0/G1期。CEPC能极显著提高QGY-7703细胞胞内Ca2+浓度。由于Ca2+作为细胞内重要的第二信使，在细胞凋亡过程中起着重要作用，细胞内Ca2+浓度的升高，可能激活相应的蛋白激酶和磷酸酶，最终导致凋亡发生。因此，CEPC处理QGY-7703细胞后使胞内Ca2+浓度较大幅度升高可能是导致人肝癌细胞发生凋亡的机制之一。本项研究结果提示：菹草类胡萝卜素抽提物具有很强的抗肝癌作用，具有进一步研究和开发的价值。4菹草功能性红心蛋颗粒饲料的研制开发及蛋鸭喂养试验采用干燥脱水、粉碎、造粒和包装的工艺，将鲜菹草加工成了颗粒饲料(浓缩料)，并实现了菹草颗粒饲料的中试生产。通过蛋鸭喂养试验和成分分析对菹草颗粒饲料的功能和价值进行了评价。4.1蛋鸭喂养试验结果表明：在一定范围内，菹草颗粒的添加量与红心蛋的平均色度、色度在15度以上红心蛋所占比例呈现一定的量效关系。将20％的菹草颗粒与80％的普通蛋鸭配合饲料混合组成的饲料综合效果最好，喂养第4d即使蛋黄平均色度由对照组的7度上升到15度，其差异达到极显著水平(P＜0.01)；喂养13d、14d时色度15度以上红心蛋占所产蛋总数的80％，并全部达到14度以上；该试验组饲料可显著增加平均蛋重(P＜0.05)，而且维持很高的产蛋率。4.2对本课题组中试生产的菹草粉、菹草颗粒及试验优选的红心蛋颗粒饲料进行了理化和营养成分检测，结果表明：菹草粉的粗蛋白含量为13.36％、总类胡萝卜素的含量为463.1mg/kg，两者都大大高于玉米，而粗蛋白与小麦麸相近；菹草颗粒的主要成分含量分别为：干物质90.05％、粗蛋白12.96％、粗脂肪4.36％、粗纤维4.75％、无氮浸出物54.16％、粗灰分13.82％、钙1.72％、总磷0.24％。配制的红心蛋颗粒饲料的主要指标符合部颁标准(SB/T10262-1996生长鸭、产蛋鸭、肉用仔鸭配合饲料)的要求。由于菹草粉和菹草颗粒饲料含有多种营养成分，具有较全面的营养价值，特别是它含较高的蛋白质、必需氨基酸、类胡萝卜素及其它维生素，将它以一定比例与普通蛋鸭饲料混合，营养成分得到进一步的互补和优化，这可能是菹草颗粒饲料在提高蛋黄色度的同时、又能促进蛋鸭生长、增加蛋重、维持较高产蛋率的重要原因。菹草颗粒饲料的功能和价值体现在它具有禽蛋赋色、营养和保健功能，而且其配制和使用易于实现标准化，储运方便，具有良好的应用前景。本研究受到了教育部博士点基金项目(20020504008)、湖北省科技攻关计划项目(2003AA204B07)及有关企业的资助。本项目基础研究和应用开发的顺利完成，有利于充分开发丰富的野生菹草资源，提高菹草深加工的技术含量、工业化水平及相关产品的附加值，拉动和发展新的产业链；利用菹草颗粒饲料生产的红心蛋，可进一步开发为有益于人民健康的功能食品，将产生良好的社会效益和经济效益。经国内外文献和情报检索表明：以上有关菹草红色类胡萝卜素结构、类胡萝卜素抽提物抗肝癌活性及菹草功能性红心蛋颗粒饲料的研究未见报道。4.期刊论文王海滨.黄进.张民.彭光华.刘良忠.任丹丹.李忠.张声华.WANGHai-bin.HUANGJin.ZHANGMin.PENGGuang-hua.LIULiang-zhong.RENDan-dan.LIZhong.ZHANGSheng-Hua菹草类胡萝卜素提取物诱导人肝癌细胞QGY-7703凋亡的细胞学观察-食品科学2005,26(5)采食菹草的蛋鸭所产红心蛋蛋黄的类胡萝卜素提取物具有良好的抑制S180肿瘤的作用,为阐明其抗肿瘤作用机制,研究了菹草类胡萝卜素提取物(CEPC)对人肝癌细胞QGY-7703细胞增殖和凋亡的影响,本文报道采用体外培养、细胞增殖实验,然后以可见光、荧光、激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)观察肝癌细胞的形态变化.结果表明:分别用含10、20和40μmol/L的CEPC的培养介质处理QGY-7703细胞24、48和72h,在可见光、荧光显微镜、LSCM下观察细胞形态,分别出现了肝癌细胞数量明显减少、皱缩变形、体积缩小、触角伸长、细胞表面凸起多个小泡,显示亮黄色荧光的细胞核呈现新月状、条状甚至碎片状形状,细胞核中呈黄色的DNA面积较明显减小等典型的凋亡细胞形态特征.用荧光显微镜观察计数凋亡细胞的方法测定了CEPC对QGY-7703细胞凋亡指数影响,细胞凋亡指数随CEPC剂量的增加及处理时间的延长而上升.因此CEPC对QGY-7703细胞的增殖具有明显的抑制作用,在较短的时间内及使用较小的CEPC剂量能有效地诱导QGY-7703细胞凋亡.本项研究说明菹草中的类胡萝卜素化合物具有明显的抑制肝癌细胞增殖、诱导肝癌细胞凋亡的功能.5.期刊论文王海滨.任丹丹.张民.吕伟.杜鹃.张声华菹草类胡萝卜素提取条件的研究-华中农业大学学报2004,23(5)采用有机溶剂提取类胡萝卜素,对冻干菹草类胡萝卜素的浸提条件进行了研究,得到的最佳参数是:浸提液为石油醚-丙酮(1∶3,v/v)混合溶剂,料液比为90mL/g,在常温下分3次浸提,总浸提时间为1.5h.在此条件下冻干菹草粉中总类胡萝卜素的提取率为95.5%.6.期