表面修饰对镁合金WE42生物相容性的影响

栽蚤葬灶躁蚤灶酝藻凿允熏Jan圆园10熏灾燥造38晕燥1经皮冠状动脉介入治疗（PCI）已成为冠心病血运重建的重要手段，冠状动脉内支架作为一种机械性支撑装置能够有效地减少单纯球囊成形术后的血管急性闭塞，但本体金属支架的持续存在会造成一些长期不良反应，如再狭窄、持久的物理性激惹、内皮功能障碍、再内皮化延迟和血栓源性等[1-4]。生物可降解材料制成的支架既能在短期内为血管提供支撑，又可以避免金属支架长期存留所造成的并发症。本研究利用微弧氧化（MAO）技术对WE42镁合金进行微弧氧化及聚左旋乳酸（PLLA）封孔表面修饰，并对材料表面修饰前后材料的生物相容性进行评价，为今后制备载药支架奠定基础。*天津市应用基础及前沿技术研究计划重点项目（项目编号：08JCZDJC17900）作者单位：300070天津医科大学（查磊，周津）；天津市胸科医院心内科（刘寅，曹路）吟通讯作者E-mail:[e-mail]表面修饰对镁合金WE42生物相容性的影响*查磊刘寅吟曹路周津摘要目的：评价微弧氧化（MAO）及聚左旋乳酸（PLLA）封孔表面修饰对生物可降解WE42镁合金材料的生物相容性的影响。方法：以微弧氧化法制备陶瓷膜表面的WE42镁合金材料（MAO/WE42），再在陶瓷膜膜层表面进行PLLA封孔处理，制成MAO+PLLA修饰WE42镁合金材料（MAO+PLLA/WE42）；扫描电镜观测材料在体外生理环境中的表面微观形貌；用材料浸提液处理人脐静脉内皮细胞，MTT比色法检测细胞相对增殖率（砸郧砸），判断细胞毒性的级别；同时测定与材料表面接触2min后血浆的凝血时间（PT、RT）及经材料浸提液处理的2%人血悬液的溶血率（hemolyticratio）。结果：扫描电镜观察显示WE42浸泡后出现严重腐蚀，MAO/WE42和MAO+PLLA/WE42材料浸泡前后变化较轻,未出现明显的腐蚀孔洞；WE42细胞毒性较强，而MAO/WE42、MAO+PLLA/WE42无明显细胞毒性作用；MAO/WE42、MAO+PLLA/WE42具有一定的抗凝血性能；溶血试验结果显示，MAO/WE42和MAO+PLLA/WE42的溶血率均低于WE42，且MAO+PLLA的抗溶血性能优于MAO（P0.01）。结论：微弧氧化表面修饰可改善WE42的生物相容性，PLLA封孔处理可提高WE42的抗溶血性能，MAO+PLLA作为可控吸收镁合金药物洗脱支架的载药层是安全的。关键词合金镁生物相容性材料材料试验显微镜检查,电子,扫描乳酸脐静脉内皮细胞EffectsofSurfaceModificationonBiocompatibilityofMagnesiumAlloyWE42ZHALei,LIUYin,CAOLu,ZHOUJinTianjinMedicalUniversity,Tianjin300070,ChinaAbstractObjective:Toevaluatetheeffectsofmicro-arcoxidation(MAO)andpoly-L-lacticacid(PLLA)surface-mod鄄ificationonthebiocompatibilityofmagnesiumalloyWE42.Methods:Micro-arcoxidationsurface-modificatedWE42(MAO/WE42)materialsandMAO+PLLAsurface-modificatedWE42(MAO+PLLA/WE42)materialswereprepared.Thesurfaceto鄄pographyofmaterialsinthephysiologicalenvironmentwasobservedinvitrobyscanningelectronmicroscopy.Thehumanum鄄bilicalveinendothelialcells(HUVECs)weretreatedbyleachingliquorofmaterials.Therelativegrowthrate(RGR)wasas鄄sessedbyMTTassaytoevaluatethelevelofcytotoxicity.Thecoagulationtime(PT,RT)andhemolyticratioweredeterminedtoevaluatethebloodcompatibilityofthosematerials.Results:TheobservationofscanningelectronmicroscopyindicatedthatWE42corrodedseriouslyafterimmersion.TherewerenoobviouscorrosionholesonthesurfaceofMAO/WE42andMAO+PLLA/WE42materialsafterimmersion.ItwasfoundthatthereweregoodanticoagulantpropertiesbutnoapparentcytotoxicityinMAO/WE42andMAO+PLLA/WE42materials.TheresultsofhemolysistestshowedthattherewerelowerhemolysisratesinMAOandMAO+PLLAmaterialsthanthatofWE42.ThematerialofMAO+PLLApossessedthebetteranti-hemolyticproper鄄tiesthanthatofMAO(P0.01).Conclusion:Micro-arcoxidationsurfacemodificationimprovedthebiocompatibilityofWE42.PLLAsealingtreatmentimprovedtheanti-hemolyticperformanceofWE42.MAO+PLLAprovidedasafedrug-loadingsurfacefordrug-elutingstentsofmagnesiumalloy.Keywordsalloysmagnesiumbiocompatiblematerialsmaterialstestingmicroscopy,electron,scanninglacticacidumbilicalveinsendothelialcells26天津医药圆园10年1月第38卷第1期1材料与方法1.1材料试验选用铸态WE42镁合金（天津大学提供）及316L不锈钢（用于凝血试验的阴性对照）。制成10mm伊10mm伊2mm的方形试件，采用WE42镁合金的MAO法进行表面修饰，形成陶瓷膜膜层，制成WE42微弧氧化修饰（MAO/WE42）材料，再在陶瓷膜膜层表面进行PLLA封孔处理，制成MAO+PLLA修饰的WE42（MAO+PLLA/WE42）材料。材料经60Co辐射灭菌后备用。人脐带取自天津市中心妇产科医院健康产妇分娩后的新生儿脐带，采用胶原酶消化法提取人脐静脉内皮细胞（HUVEC），经免疫组化方法鉴定峪因子相关抗原阳性。新鲜人静脉血采自天津市胸科医院健康志愿者，与血液保存液（ACD）配制成ACD血液。MTT试剂盒购自北京普利莱公司。1.2方法1.2.1镁合金材料表面扫描电镜观察镁合金材料经丙酮、无水乙醇处理后，于37益D原匀葬灶噪忆泽液（责匀苑援源）中浸泡圆源澡后，表面喷金，采用栽阅悦蕴原源愿园园型场发射扫描电镜（杂耘酝）观察浸泡前后的镁合金表面微观形貌。1.2.2MTT细胞毒性试验取第2~3代HUVEC用于试验。将镁合金试件在超净台中置于无菌瓶中，按照ISO10993-1标准即材料表面积与浸提介质为3cm2/mL的比例加入无菌培养液,于37益下浸泡24h，制备浸提液。将HUVEC以5伊105/孔接种于96孔板中，待细胞贴壁后舍弃原培养液，每孔加细胞培养液及浸提液各1园园滋蕴，使孔内最终浓度为50%，分为WE42组、MAO/WE42组、MAO+PLLA/WE42组，每组设9个复孔，同时设空白对照组及本底组，对照组为100%细胞培养液，本底组为无细胞培养基对照。继续培养24h后，加入1g/LMTT，孵育4h后取出，吸弃上清，每孔加入二甲基亚砜（DMSO）150滋L震荡10耀15min,用酶标仪在570nm波长处测量光密度（韵阅）值。计算细胞相对增殖率（砸郧砸），砸郧砸越（韵阅实验原韵阅本底）/（韵阅对照原韵阅本底）伊100%。根据6级毒性评分标准转换成毒性级（按IS017405文件规定细胞毒性0耀1级为合格）。1.2.3血液相容性试验（1）凝血实验：取适量的ACD血液，3000r/min离心15min，取上清液，得到贫血小板血浆。ACD血液2000r/min离心10min，取上清液，得到富血小板血浆。在试件表面滴加150滋L血小板血浆预温2min后，取50滋L浆于血凝仪中，仪器自动测试凝血酶原时间（PT）。在试件表面滴加150滋L血小板血浆预温2min；而后过程与测试PT基本相同，仪器自动测试血浆复钙时间（recalcificationtime,RT）。以316L不锈钢作为阴性对照，各重复6次。（2）溶血试验：取适量新鲜健康ACD血液用生理盐水稀释成2%人血悬液，将材料浸提液、生理盐水(阴性对照，员份）和双蒸水（阳性对照，员份）各圆皂蕴，分别加入圆豫人血悬液圆皂蕴，其中材料浸提液（宰耘源2、MAO/WE42、MAO+PLLA/WE42材料各6个大小一致样品），分别经60Co辐射灭菌后置于生理盐水中37益浸提72h，按照ISO10993-1标准，试件表面积/浸体介质=3cm2/mL，制备材料生理盐水浸提液。各取员份，分远组。猿苑益水浴员澡，苑缘园伊早离心缘皂蚤灶，取上清液员皂蕴，在分光光度计于428nm处测定各样本OD值,计算溶血率。溶血率越（样品韵阅值原阴性对照韵阅值）/（阳性对照韵阅值原阴性对照韵阅值）伊员园园豫（溶血率约缘豫符合生物材料溶血性的要求）[5]。1.3统计学方法采用SPSS15.0统计软件包进行处理，各组数据以均数依标准差（曾依泽）表示，多个样本均数比较采用方差分析及SNK-q检验，P0.05为差异有统计学意义。2结果2.1镁合金材料表面扫描电镜观察在37益D-Hank’s液中浸泡24h后，WE42、MAO/WE42和MAO+PLLA/WE42材料均有不同程度的降解。浸泡后WE42表面有结构疏松且分布不均匀的沉淀颗粒堆积，表面孔隙结构增多，出现较重的龟裂，形成大的腐蚀孔洞；MAO/WE42和MAO+PLLA/WE42材料浸泡前后变化较轻，且沉淀颗粒较宰耘源圆均匀，变化相对较小，未出现明显的腐蚀孔洞，见图员。2.2镁合金材料浸提液对HUVEC的毒性作用WE42组与对照组的OD值比较差异有统计学意义（P﹤0.01）；MAO/WE42组、MAO+PLLA/WE42组的OD值和对照组之间差异无统计学意义（P﹥0.05），见表1。WE42组、MAO/WE42组和MAO+PLLA/WE42组的RGR分别为58%、90%、91%，细胞毒性分别为2级、1级和1级。2.3PT和RT比较各组之间PT比较差异无统计学意义（P﹥0.05）；RT测定结果表明，WE42组、MAO/WE42组、MAO+PLLA/WE42组均高于阴性对照组（均P0.01），MAO/WE42组与MAO+PLLA/WE42组差异无统计学意义（P﹥0.05），见表2。2.4材料的溶血率分析溶血试验中，WE42组、MAO/WE42组、MAO+PLLA/WE42组的溶血率（%）分别为50.37依0.42、3.67依0.47、1.79依0.67，差异有统计学意义（F=28010.34，P约0.01），MAO/WE42组、表1MTT法各材料的OD值比较（灶越怨，曾依泽）对照组（员）宰耘源圆组（圆）酝粤韵/宰耘源圆组（猿）酝粤韵垣孕蕴蕴粤/宰耘源圆组（源）云0.0835