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食品微生物检验规范操作基础培训4接种、分离纯化福建出入境检验检疫局技术中心食品所微生物实验室2010.05主要内容：§1清洗、消毒和灭菌操作§2培养基的制备§3采样和取、制样§4接种、分离纯化§5制片、染色及显微观察§6实验室安全基础知识§4接种、分离纯化4.1接种将微生物接到适于它生长繁殖的人工培养基上或活的生物体内的过程叫做接种。4.1.1接种工具1．接种针2.接种环3.接种钩4.5.玻璃涂棒6.接种圈7.接种锄8.小解剖刀图4-1接种和分离工具4.1.2无菌操作培养基经高压灭菌后，用经过灭菌的工具（如接种针和吸管等）在无菌条件下接种含菌材料（如样品、菌苔或菌悬液等）于培养基上，这个过程叫做无菌接种操作。在实验室检验中的各种接种必须是无菌操作。接种时，打开培养皿的时间应尽量短。用于接种的器具必须经干热或火焰等灭菌。接种环的火焰灭菌方法：通常接种环在火焰上充分烧红（接种柄，一边转动一边慢慢地来回通过火焰三次），冷却，先接触一下培养基，待接种环冷却到室温后，方可用它来挑取含菌材料或菌体，迅速地接种到新的培养基上。然后，将接种环从柄部至环端逐渐通过火焰灭菌，复原。不要直接烧环，以免残留在接种环上的菌体爆溅而污染空间。平板接种时，通常把平板的面倾斜，把培养皿的盖打开一小部分进行接种。在向培养皿内倒培养基或接种时，试管口或瓶壁外面不要接触底皿边，试管或瓶口应倾斜一下在火焰上通过。4.2接种法与纯培养的分离技术含有一种以上的微生物培养物称为混和培养物（Mixedculture）。如果在一个菌落中所有细胞均来自于一个亲代细胞，那么这个菌落称为纯培养（Pureculture）。在进行菌种鉴定时，所用的微生物一般均要求为纯的培养物。得到纯培养的过程称为分离纯化。4.2.1平板划线分离培养法平板划线分离培养法，用无菌的接种环取培养物少许在平板上进行划线，使培养物中混在的多种细菌在培养基表面分散生长，各自形成菌落，根据菌落的形态及特征，挑选单个菌落，经过移种而获得纯种细菌（纯培养）。分离细菌的方法很多，最常用的是平板划线分离法。根据划线的方式不同有斜线法、曲线法、方格法、放射法、四格法等。（图4-2）图4-2平板划线分离法1.斜线法2.曲线法3.方格法4.放射法5.四格法1.曲线划线分离法1)先将接种环火焰灭菌,待冷后取培养物少许;2)左手拿起平板，以中指为支点，并用拇指和食指将平板盖打开；3)右手迅速将取有培养物的接种环从打开的空间插入平板内，使接种环与培养基表面呈45℃角，在酒精灯上方5~6cm处划线接种。先在平板上1/5处轻轻涂布，然后即可左右来回以曲线形式作连续划线接种，线与线间留有适当距离，将整个平板表面划满曲线；4)注明标识后，置35℃培养箱中培养，一般在18~24小时后观察结果。2.斜线(分区)划线分离法1)用接种环先将培养物涂布于平板1区并作数次划线,再在2、3……区依次划线。2)每划完一个区域，均将接种环灭菌一次，待冷后再划下一区域。3)每一区域的划线均接触上一区域的接种线1~2次，使接种量逐渐减少，以获得单个菌落。4)其他操作与上述曲线划线分离法相同。斜线接种示意图3.方格划线法将培养物涂布于平板上1/5处，接种环经火焰灭菌后，自1/5划线处作平行划线5~6条，将接种环灭菌后，划垂直线5~6条，使呈正方形格。其他操作同前。细菌在固体培养基表面只能在固定的地方生长繁殖，经过一定的培养时间后，可形成肉眼可见的菌落。菌落中只含有一种细菌，而每种细菌的菌落各有其特征。菌落形态往往有助于初步识别细菌；还可以由此获得细菌而进行一系列的鉴定。识别菌落的能力是从事微生物检验人员的极为重要的基本功。菌落形态观察1)大小:以mm表示。菌落的大小随细菌种类、培养基及培养时间等条件而不同。同一种细菌在同一平板上，在密集处的菌落比疏散处小。因此，表示菌落大小时，应注明培养基名称。一般以培养18~24小时后，选散在处的菌落大小。1mm左右为小菌落；2~3mm为中等大；3mm以上为大菌落。2)形状及边缘：圆形、不规则、放射状、树根状、边缘整齐、波形、锯齿状、卷发状等。3)隆起：平的、突起的、凸面的、凸形的等。4)表面：光滑（S型）、粗糙（R型）；有无光泽等。图4-3细菌的培养特征1.点状2.圆形3.丝状4.不规则形5.假根状6.纺锤状7.扁平8.隆起9.凸起10.垫状11.脐状12.边缘整齐13.波状14.裂片状15.啮蚀状16.丝状17.卷发状18.丝线状19.刺毛状20.串珠状21.疏展状22.树根状23.假根状24.丝状25.串珠状26.乳头状27.绒毛状28.树根状29.量杯状30.萝卜状31.漏斗状32.囊状33.层状34.絮状35.环状36.蹼状37.膜状5)构造:均匀、露滴状、颗粒状、发状、皱招状等。6)颜色：无色、白色、灰色、灰白色或乳白色、荧光绿、金黄色、柠檬色、红色等、7)透明度：透明、半透明、不透明、微透明等。8)硬度：硬、软、干燥、湿润，是否附着于培养基上或嵌入培养基内不易刮取。9)质地：脂状、粘液状、膜状等。10)乳化性：在盐水中研磨是否形成均匀乳剂或颗粒状。11)溶血性：在血平板上，菌落周围有无溶血环。4.2.2斜面接种法主要用于经划线分离培养所获得的单个菌落的移种，以及观察细菌的某些培养特征。以菌种移种为例，其接种方法是：1.取一菌种管和培养基管，置左手食指、中指、无名指间，拇指压住两管底部上侧面，使菌种管位于外侧，培养基管位于内侧。2.右手拇指和食指分别旋松两管棉塞。火焰灭菌接种环。3.以右手小指与手掌，小指与无名指分别夹取棉塞（先外管后内管），将两管口迅速通过火焰1~2次。4.将已灭菌的接种环伸入菌种管中，从斜面上取菌少许，迅速伸入待接种的培养基管中，在斜面底部向上划一条直线，然后从底部起向上作曲折连续划线，直至斜面上方顶端。5.取出接种环，火焰灭菌管口，塞上棉塞（先塞内管）；最后将接种环经火焰灭菌放好。6.做好标识，置35℃培养箱中培养18~24小时。斜面培养一般形成均匀一致的菌苔。一般可观察表面、透明度、色泽等特征。图4-4斜面接种时的无菌操作(1)接种灭菌(2)开启棉塞(3)管口灭菌(4)挑起菌苔(5)接种(6)塞好棉塞4.2.3液体接种法1.如斜面接种法持好菌种管及培养基管。2.灭菌接种环，从菌种管取菌，伸入培养基管中，在接近液面的管壁上方轻轻研磨，并沾取少许培养基液体调和，使细菌混合于培养基的液体中。液体培养基一般以18~24小时培养后观察生长特征。肉汤培养可观察如下几项：a.发育程度：有无生长、微弱、中等、旺盛。b.混浊度：有无及程度（混、中等、微混、透明）、均匀混浊、有颗粒、絮状生长。c.沉淀:有无及量多少、性状（粉状、颗粒状、絮状、沾性）。d.表面：有无生长、性状（膜状、环状）、菌膜厚薄及表面特征（光滑、颗粒、皱状）。e.其他：有无特殊气味，色素。如果是糖发酵培养基则主要观察是否产酸和有无气体。4.2.4穿刺接种法多用于保存菌种、观察动力及厌氧培养等也可以用于观察细菌的某些生化反应。1.如斜面接种法持好菌种管及培养基管。2.以灭菌接种针从菌种管取菌，垂直刺入培养基的中心（半固体或一般琼脂高层）直达近管底部（但不能完全刺到管底），接种针应沿原路退出。3.经培养后半固体培养基可观察到：沿穿刺线生长，线外的培养基清亮表示细菌无动力；穿刺线模糊不清，或沿穿刺线向外扩散生长，或整个培养基混浊表示细菌有动力。4.2.5倾注平板法首先把微生物悬液通过一系列稀释，取一定量（1mL）的稀释液加入已熔化并冷却至45~50℃的15mL（使用直径90mm的平皿时）普通琼脂管中，立即摇匀，趁琼脂未凝固前倾注于已灭菌的平皿中，待凝固之后，将平板倒置在培养箱中培养。（图4-5a）培养后观察，细菌大部分分散于琼脂层内，形成深层菌落，有一部分可生长于表面。图4-5倾注平板法（a）涂布平板法（b）图解1.菌悬液2.熔化的培养基3.培养物4.无菌水稀释倒平板和涂布法4.2.6涂布平板法首先把微生物悬液通过适当的稀释，取一定量的稀释液放在无菌的已经凝固的琼脂平板上，然后用灭菌的L型玻璃棒把稀释液均匀地涂布在培养基表面上，经恒温培养后即可观察。（图4-5b）4.3微生物的培养研究和鉴定细菌时所提到细菌的特征指的是细菌菌落的特征，而不是单个细菌的特征。大量食品微生物的质量检测是对可见菌株的检测，现在衍变到给待检测细菌提供适当的条件使之代谢繁殖后再进行检测。因此在细菌学研究中，最基本的要求是有能促使单个细菌生长和繁殖的物质和方法。能给细菌提供适当生长环境的营养物质称为培养基。根据接种培养方式的不同，可将培养基以多种形式分装到试管、三角瓶或螺帽瓶中，试管或三角瓶的瓶口可用适当的棉塞、金属帽、塑料帽等盖紧。螺帽的优势是能够阻止蒸汽蒸发，避免培养基在保存过程中干燥。4.3.1培养的类型1.液体批量培养：在液体培养基中培养，培养过程不需要加入新的培养基。2.琼脂斜面培养：在试管中装入约5mL固体培养基融化后摆成斜面冷却。将接种物涂布到斜面或用接种环在斜面上划线。3.穿刺培养：将含琼脂培养基的试管或瓶子垂直放置，使培养基凝固，用接种针挑取少量接种物垂直穿入至容器的中部。4.半固体培养：菌株生长的培养基含有足够的琼脂（0.02%~0.3%）使其有一定的黏度，但却没有完全固化。5.振荡培养：用摇床进行微生物振荡培养。6.平板培养：平板划线法、倾倒平皿法。根据培养时是否需要氧气，可分为：1.好氧培养：(1)固体表面培养法：斜面、培养皿、克氏瓶等(2)液体培养法：静止、摇瓶振荡2.厌氧培养：(1)深层穿刺培养(2)化学吸氧与深层穿刺相结合(3)抽气法：干燥器、简易的真空和气体交换法、厌氧罐4.3.2微生物的培养方法谢谢！