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专题2:微生物的培养与应用微生物：指形体微小(小于0.1mm)，结构简单，在适宜环境中能迅速生长繁殖，易变异，通常要借助显微镜才能看清楚的生物。大约有10万种。微生物原核生物界原生生物界真菌界病毒(细菌、放线菌、蓝藻)(酵母菌、霉菌、大型真菌)(草履虫、变形虫、衣藻)(噬菌体、艾滋病毒)1、细菌的形态：球形、杆形、螺旋形。螺旋菌球菌杆菌2、细菌的结构所有的细菌所共有的基本结构有哪些？某些细菌所具有的特殊结构有哪些？（拟核）基本结构特殊结构*细胞壁•结构特点：坚韧且有弹性•细胞壁有哪些功能？•①固定细胞外形；②保护细胞免受外力的损伤；③阻拦大分子物质进人细胞；④使细胞具有致病性及对噬菌体的敏感性。伤寒杆菌细胞壁中含毒素结构化学本质功能或应用细胞壁细胞膜细胞质基质核糖体质粒贮藏性颗粒拟核主要是肽聚糖保护和维持细胞形状等同真核生物同真核生物多种成分新陈代谢的主要场所小型DNA分子同真核生物同真核生物控制细菌的抗药性、固氮、抗生素生成多种成分贮藏营养物质或代谢废物，如淀粉粒、硫粒大型环型DNA控制细菌主要遗传性状特殊的结构荚膜主要成分为多糖，与其致病性有关。芽孢细菌生长到一定阶段产生的一种抗逆性很强的休眠体,以度过不良的环境。荚膜、鞭毛、芽孢一般说，芽孢不起繁殖作用，只起度过不良环境的作用，芽孢对热、紫外线和许多有毒化学物质有很强的抗性。3、细菌的代谢自养硝化细菌、铁细菌、硫细菌等。异养大肠杆菌、乳酸菌、枯草杆菌等。腐生——依靠分解动植物的遗体（尸体、粪便和枯枝落叶），从中吸取有机物来生活。例如枯草杆菌，它可以引起食物的腐败。寄生——从活的动植物体内吸取有机物来生活。例如寄生在肠道内的痢疾杆菌，它能够引起细菌性痢疾。需氧型：好氧性细菌。如：枯草杆菌、硝化细菌、铁细菌、根瘤菌等。厌氧型：厌氧性细菌。如：破伤风杆菌，大肠杆菌，乳酸菌等。•异养需氧型•异养厌氧型•自养需氧型•自养厌氧型问：细菌的代谢类型属于什么方式?在生态系统中处于什么地位?分解者或消费者生产者3、细菌的繁殖——二分裂20分钟——30分钟，分裂一次无鞭毛的球菌：菌落较小较厚、边缘整齐.有鞭毛的细菌：菌落大而扁平、边缘波状或锯齿状.问：菌落在生态学上属于什么单位？菌落问：什么叫菌落？菌落可以作为菌种鉴定的重要依据。单个或者少数细菌在固体培养基上大量繁殖时，会形成一个肉眼可见的、具有一定形态结构的子细胞群体。几种菌落三册书中所有细菌的种类例如：乳酸菌的有关知识细胞类型：原核细胞代谢类型：异养厌养代谢产物：乳酸生产用途：酸奶、泡菜可产生乳酸的生物：人无氧呼吸马铃薯块茎玉米的胚、甜菜块根•菌体由分枝状的菌丝构成–基内菌丝(营养菌丝)—吸收现成的有机物(大多营腐生生活)–气生菌丝—到一定阶段分化成孢子丝，上有成串的孢子。单细胞的原核生物，分布广泛。放线菌的生殖——孢子生殖70%以上的天然抗生素均由土壤放线菌产生。如头孢拉定、链霉素、金霉素、土霉素、庆大霉素、春雷霉素、四环素、红霉素和卡那霉素等。HIV病毒整合酶的功能是将病毒DNA整合到宿主细胞染色体中1、病毒的结构病毒结构核酸(DNA或RNA)衣壳(蛋白质)；由衣壳粒构成核衣壳囊膜(有的病毒具有)由蛋白质、多糖和脂类构成,上常有刺突；如流感病毒.衣壳化学组成形态单位功能排列方式由蛋白质构成衣壳粒通常由1-6个多肽分子组成保护核酸决定抗原特异性使病毒呈现不同的形态2、病毒的增殖吸附注入核酸合成核酸和蛋白质释放装配只能在宿主的活细胞中进行类群结构特点遗传物质繁殖方式举例病毒原核生物界真菌界原生生物界无细胞结构(核酸衣壳囊膜)原核(细胞壁、膜、质)真核(细胞壁、膜、质、核)真核(细胞膜、质、核)噬菌体烟草花叶病毒流感病毒细菌(形状菌)放线菌霉菌、蘑菇、酵母菌衣藻、草履虫、变形虫DNA或RNADNADNADNA增殖：吸附→注入→合成→装配→释放分裂生殖(二分裂)孢子生殖出芽生殖分裂生殖有性生殖了解有关培养基的基础知识，进行无菌技术的操作，进行微生物的培养。一、课题目标：掌握培养基的制备、高压蒸气灭菌和平板划线法等基本操作技术，熟练、规范地进行无菌操作，成功地培养微生物。无菌技术的操作。二、课题重点和难点：三、技能目标：一、基础知识：（一）培养基培养基（培养液）是由人工方法配制而成的，专供微生物生长繁殖使用的混合营养液。（1）按物理状态来分：培养基可分为固体培养基和液体培养基。其中固体培养基用于菌种分离、鉴定菌落等。（2）按功能来分，可分为选择培养基和鉴别培养基。（3）按成分来分，可分为天然培养基和合成培养基。1.培养基的类型和用途2.不同的微生物往往需要采用不同的培养基配方(参考教材附录内容)3.不管哪种培养基，一般都含有水、碳源、和氮源、无机盐、等营养物质，另外还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质,例如:生长因子(即细菌生长必需，而自身不能合成的化合物,如维生素、某些氨基酸、嘌呤、嘧啶)以及氧气、二氧化碳、渗透压等的要求。选择培养基加入青霉素的培养基:分离酵母菌、霉菌等真菌加入高浓度食盐的培养基:分离金黄色葡萄球菌不加氮源的无氮培养基:分离固氮菌不加含碳有机物的无碳培养基:分离自养型微生物加入青霉素等抗生素的培养基:分离导入了目的基因的受体细胞加入氨基喋呤、次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷的培养基:分离杂交瘤细胞根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。优点：标准化生产，组分和含量相对固定;成本低缺点：缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要。合成培养基:天然培养基有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。优点：营养成分丰富，培养效果好缺点：来源受限;成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析;易发生支原体污染;天然培养基：固体培养基：菌落4.培养基的用途液体培养基：增菌固体培养基：纯化，增菌半固体培养基：动力检测，保种（二）无菌技术1.无菌技术的概念无菌操作泛指在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。无论是随后将要学到的倒平板、平板划线操作，还是平板稀释涂布法，其操作中的每一步都需要做到“无菌”，即防止杂菌污染。只有熟练、规范地进行无菌操作，才可能成功地培养微生物。（１）消毒定义：利用化学或物理方法，杀死大部份致病微生物的过程。区分为高程度消毒、中程度消毒、低程度消毒三种方式。2.消毒与灭菌的概念及两者的区别（2）灭菌的定义：以化学剂或物理方法消灭所有微生物，包括所有细菌的繁殖体、芽孢、霉菌及病毒，而达到完全无菌之过程。灭菌与消毒技术是微生物有关工作中最普通也是最重要的技术。1、煮沸消毒法:100℃煮沸5-6min2、巴氏消毒法：70-75℃下煮30min或80℃下煮15min3、化学药剂消毒法:用75%酒精、新洁尔灭等进行皮肤消毒;氯气消毒水源4、紫外线消毒……(1)消毒的方法：3.常用的消毒与灭菌的方法1、灼烧灭菌2、干热灭菌：160-170℃下加热1-2h。3、高压蒸气灭菌：100kPa、121℃下维持15-30min.(2)灭菌的方法：最常用的灭菌方法是高压蒸汽灭菌，它可以杀灭所有的生物，包括最耐热的某些微生物的休眠体，同时可以基本保持培养基的营养成分不被破坏。有些玻璃器皿也可采用高温干热灭菌。为了防止杂菌，特别是空气中的杂菌污染，试管及玻璃烧瓶都需采用适宜的塞子塞口，通常采用棉花塞，也可采用各种金属、塑料及硅胶帽，它们只可让空气通过，而空气中的其他微生物不能通过。而平皿是由正反两平面板互扣而成，这种器具是专为防止空气中微生物的污染而设计的。硅胶主要成分是二氧化硅，化学性质稳定，不燃烧硅胶有很强的吸附能力，对人的皮肤能产生干燥作用主要用于仪器、仪表、设备等在密闭条件下的吸潮防锈分类定义方法灭菌法杀灭一切微生物物理法：热力、辐射、微波、等离子体化学法：醛类、烷化剂高效消毒法杀灭一切致病微生物紫外线、含氯剂、臭氧、复配剂等中效消毒法杀灭除芽孢外的致病微生物超声波、碘类、醇类、酚类低效消毒法杀灭细菌繁殖体、亲脂病毒单链季胺盐、双胍类、中草药、金属离子无菌技术3.微生物实验室培养的基本操作程序1、器具的灭菌2、培养基的配制3、培养基的灭菌4、倒平板5、微生物接种6、恒温箱中培养7、菌种的保存1.无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？2.请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。（1）培养细菌用的培养基与培养皿（2）玻棒、试管、烧瓶和吸管（3）实验操作者的双手答：无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。答：（1）、（2）需要灭菌；（3）需要消毒。三、实验操作1.制备牛肉膏蛋白胨培养基（用于培养细菌）1．计算、称量2．溶化3．调pH：pH7．64．过滤：这一步可以省去。5．分装：分装过程中注意不要使培养基沾在管口或瓶口上，以免沾污棉塞而引起污染。分装三角烧瓶的量以不超过三角烧瓶容积的一半为宜。6．加塞7．包扎操作步骤8．灭菌:将50ml培养基用玻棒转移至三角锥瓶中，塞上棉花塞，包上牛皮纸，再放入高压蒸气灭菌锅，在压力为100kPa、温度为121℃，灭菌15～30min。将培养皿用旧报纸包裹，放入干热灭菌箱内，在160～170℃下灭菌2h。9．倒平板:待培养基冷却到50℃左右时，在酒精灯附近倒平板。（倒平板操作见课本）2d后观察平板，无杂菌污染才可用来接种.10．无菌检查：将灭菌的培养基放入37℃的温室中培养24—48小时，以检查灭菌是否彻底。倒平板技术1.培养基灭菌后，需要冷却到50℃左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？答：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？4.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？答：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。答：空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。2、纯化大肠杆菌接种方法有：平板划线法和稀释涂布平板法平板划线法:通过接种环在琼脂固体培养基表面连续画线的操作,将聚集的菌钟逐步稀释分散到培养基的表面.在数次画线后,可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体,这就是菌落.微生物的接种技术1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？答：操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？答：以免接种环温度太高，杀死菌种。3.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求，想一想，第2步应如何进行无菌操作？应从操作的各个细节保证“无菌”。例如，酒精灯与培养皿的距离要合适、吸管头不要接触任何其他物体、吸管要在酒精灯火焰周围等等。微生物的恒温培养微生物的恒温培养微生物的恒温培养菌种的保存1、临时保藏：接种到固体斜面培养基，菌落长成后置于4℃冰箱保存。2、长期保存：甘油冷冻管藏法四、课题成果评价（一）培养基的制作是否合格如果未接种的培养基在恒温箱中保温1～2d后无菌落生长