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生物转化法合成谷胱甘肽的研究张磊薛钊坤（浙江工业大学生物与环境工程学院杭州310014）摘要：本文以编号X23的藤黄八叠球菌为研究对象，研究其生物转化合成谷胱甘肽的可能性。通过从物理、化学和生物三方面因素改进转化条件：转化过程中以100mg/L湿菌含量加入新配制pH为7.5的转化液[1]37℃、转速200r/min的摇床转化6h，用超声波对含菌的转化液破壁10min，接着于3500r/min离心机离心20min后取上清液,为最佳的物理因素；通过正交实验分析方法得转化液最佳成份浓度为葡萄糖0.75mol/L、MgCl20.01mol/L、底物浓度0.03mol/L，找到并证实微量元素浓度20mg/L的ZnSO4·7H2O对谷胱甘肽合成酶有激活作用，为最佳化学因素；连续生物转化进行两步可使转化产量达到88.43mg/L，一次从发酵到转化两步的生产过程可产谷胱甘肽231.27mg/L，较原菌株只发酵的产量142.75mg/L提高61.94%。关键词：谷胱甘肽、藤黄球菌、生物转化RESERCHOFBIOLOGYSYNTHESISOFGLUTATHIONEZHANGLeiXUEZhao-Kun(CollegeofBiologyandEnvironmentEngineeringZhejiangUniversityofTechnology,Hangzhou,310014)Abstract:SarcinaluteastrainX23,whichwasstoredinthemicrobiologiclaboftheZhejianguniversityoftechnologywasstudiedforthebiologicaltransformofglutathione.Theconditionoftheglutathionebiologictransformandcomponentoftheproductiveliquidthroughwereimprovedthroughphysicalchemicalandbiologicfactors.TheproductiveliquidpH7.5containedSarcinalutea100mgcell/L,wasplacedinaflaskandincubatedat37℃withshakingat200r/minfor6h,thenthestrainwithproductiveliquidwassmashedfor10minbysonicate,supernatentwasgotbycentrifugationatthespeedof3500r/minfor20min,thatwastheoptimumphysicalfactor.Compositionoftheproductiveliquid,Glucose0.25mg/L、MgCl20.01mg/L、Aminoacids0.03mg/L.wasobtainedbythequadraticdesign.theZnSO4·7H2Oattheconcentrationof20mg/Lwhichwasdiscoveredandconfirmedcanactivatetheendosynthaseofglutathione,thatwastheoptimumchemicalfactor.Theresultindicatedthattheglutathioneproductionreached88.43mg/Laftertwostepsbiologictransformprocess,Theproductivityofglutathionecanbeobtained231.27mg/Lofduringthewholeprocess,whichwas61.94﹪higherthaninthesynthesis.Keywords:GlutathioneSarcinaluteabiologicsynthesis还原型谷胱甘肽（L-Glutathione，简称GSH）是由谷氨酸，半胱氨酸和甘氨酸构成的活性三肽。自1938年发表了由酵母备制谷胱甘肽的最早专利以来[3]，还原型谷胱甘肽在临床上有着广泛的应用，它能够防止皮肤色素沉积、改善皮肤光泽，是治疗肝病、重金属中毒、放射性损伤、肿瘤、白内障等疾病的有效药物，最近还发现谷胱甘肽可能具有抗艾滋病毒的功效。谷胱甘肽现在已广泛运用于食品加工的各个领域，在日本谷胱甘肽被认为是21世纪最有希望的保健食品之一。谷胱甘肽作为一种重要的氨基酸类生化药物，随着人们在食品添加剂、临床医学和运动营养学上对它的兴趣日益增长，市场需求量不断增加。目前生产谷胱甘肽最普遍的方法是发酵法生产，发酵法生产谷胱甘肽基本以酵母发酵为主，国内外尚未见到以革蓝氏阳性菌产生的酶系催化合成谷胱甘肽的报道，本课题旨在弥补这一空白。由于GSH合成酶在细菌体内的活性和产量受细菌调控，因此要提高转化率一个重要途径是优化生物转化条件。本论文通过一定方法提取细菌中相应的活性酶，研究其最适转化条件和最佳配方以提高谷胱甘肽的生物转化率。由于藤黄八叠菌的生长周期仅为酵母的1/3，利用该细菌高产谷胱甘肽合成酶菌株进行转化法生产谷胱甘肽，可以大大缩短生产周期提高经济效益，促进产业化生产。1材料与仪器1.1菌种来源藤黄八叠球菌（浙江工业大学生物实验室收集和保藏）1.2培养基1.2.1斜面培养基（完全培养基）及培养条件[2]：培养基：葡萄糖30g、蛋白胨10g、牛肉膏3g、氯化钠5g、琼脂20g定容至1L水。pH自然，1.0×105Pa灭菌20min。1.2.2种子培养基及培养条件：葡萄糖30g、蛋白胨10g、牛肉膏3g、氯化钠5g、定容到1L，pH自然，1.0×105Pa灭菌20min。1.2.3发酵培养及培养条件：培养基：糖蜜30g、白胨25g、七水硫酸镁5g、磷酸二氢镁1gcysHCl1.5g,加水定容1000mlpH7.0,1.0×105Pa、灭菌20min。1.3TL0转化液配方[1]转化液TL0：pH7.0，K2HPO4-KH2PO4缓冲液，葡萄糖9g/L，MgCl22.05g/L，底物氨基酸0.03mol/L（谷氨酸4.4g/L，甘氨酸2.25g/L，半胱氨酸5.25g/L）。1.4主要仪器：LS-B50L立式蒸汽灭菌锅，上海医用核子仪器厂；751-GW，分光光度计,上海分析仪器厂；高速离心机LD5-10；超声波粉碎机（CPS-IA）上海超声波仪器厂，摇床（HWY-V11）上海智城分析仪器厂。2实验方法2.1菌种培养及发酵方法取实验室保藏的藤黄八叠球菌种，接种于斜面培养基上活化2代后，取2-3代长势良好的菌群，无菌操作，将菌接于种子液中，30℃摇床转速180r/min，培养20h，将含菌种子液以10%接种量用无菌移液管移取加入新配制的发酵液中，30℃摇床转速180r/min，培养18h。2.2生物转化方法将发酵后的发酵液于3500r/min离心后去除上清液，沉淀为湿菌种，加少量TLo转化液用超声波细胞捣碎机破壁10min后，按100mg/ml菌体量加入TLo转化液,于30℃、转速180r/min震荡转化6h。2.3GSH产量分析方法2.3.1胞内谷胱甘肽含量测定：ALLOXAN试剂衍生法，见文献[4]2.3.2GSH样品标准曲线：利用最小二乘法可得到两者关系，C（GSH）=（812.13*A-6.03388）×307.33相关系数R=0.9983见文献[2]2.4转化物理因素的研究对转化的温度、pH、时间、摇床转速、菌种破壁时间选择依次进行实验，以确定最佳的转化条件中物理因素。2.4.1温度发酵液按100mg/ml菌体量加入TLo转化液，用超声波破壁后，取4个三角瓶，按15ml/瓶加入三角瓶中，分别放入温度为28℃、30℃、37℃、50℃转速均为180r/min的摇床转化6h，测转化液GHS产量。2.4.2pH新配制的TLo转化液，以15ml/瓶分装4个三角瓶，用1NNaOH将pH调至6.5、7.0、7.5、8.0，同样按100mg/ml菌体等量加入4种不同pH转化液中，温度37℃摇床转速180r/min，6小时后测转化液GHS产量。2.4.3时间发酵液按100mg/ml湿菌量加入新配制的pH为7.5转化液，取250ml瓶4个，每瓶加入15ml含湿菌的TLo转化液，摇床设定37℃、180r/min，转化时间为3h、6h、9h、12h后各取出一瓶测转化液GHS产量。2.4.4摇床转速按100mg/ml湿菌量加入新配制的pH为7.5转化液，取250ml的三角瓶4个，每瓶用移液管移取15ml含湿菌转化液，放入温度为37℃转速分别设为150r/min、180r/min、200r/min、230r/min的摇床，转化6h然后测转化液GHS产量。2.4.5菌种破壁时间选择离心除去发酵液，对湿菌进行分步同时实验如下:1、湿菌1.5g加pH7.5TLo转化液15ml，用超声波破壁20min，试验号记为d2、取湿菌3g加少量pH7.5TLo转化液，摇匀用超声波破壁10min，加转化液至30ml（即含湿菌100mg/ml）分入两个三角瓶，15ml/瓶，试验号记a、b3、同时取湿菌1.5g加pH7.5Tlo转化液15ml移入三角瓶试验号记为c4、a放入冰箱冷冻，b、c、d放入37℃速200r/min摇床转化6h后，C用超声波破壁10min后和b、c、d同时以3500r/min离心机离心15min测转化液GHS产量。图.1样品GSH标准曲线Fig.1StandardlineofspecimenGSH2.5转化化学因素的研究2.5.1转化液成分用正交试验方法对转化液中葡萄糖、MgCl2、底物氨基酸的浓度的比例进行优化。2.5.2酶液激活剂酶激活剂一般以无机盐离子为主，本文选用生物实验中常用无机盐微量元素进行研究，欲寻找能激活胞内谷胱甘肽酶的微量元素。表.1微量元素的种类和浓度Table.1Speciesandconsistencyofmicro-mineral编号12345678化合物名称H3BO3CoCl2FeCl3ZnSO4MnCl2(NH4)6Mo7O24CuSO4·5N2OCaCl2化合物浓度(mg/L)0.021.000.2020.00.020.140.021.11g/L在发酵进行到18h时，用离心机离心得具有最大酶活的湿菌，按100mg湿菌/ml加入新配制的转化液，分装入9个三角瓶，15ml/瓶，编号0-8，0号为对照样不加其他微量元素，1-8号按表1加入微量元素。转化后测GSN含量。2.6转化生物因素的研究二步转化①以2.4.1中菌种破壁时间选择中编号为a、c的实验三角瓶制做方法加新配制转化液转化后记编号为a1、c1。测a1（只发酵不转化）和c1（发酵后转化一步）的GSM产量。②c1用转速3500r/min离心15min后去除第一步转化时的残菌体，上清液继续按100mg/ml加入发酵成熟的新菌种，取3个三角瓶，15mg/瓶编号H1，H2，H3进行第二步转化，测GSN产量。3结果与讨论：3.1物理因素对GSH产量的影响:3.1.1转化温度对GSH产量的影响：在转化过程中选择一般适合细菌生长实验室有培养箱的几个温度点如28℃、30℃、37℃、50℃进行转化试验，实验结果(见表2),GSH在温度较低时随温度升高而增加，37℃时产量达到最大，温度再升高，到50℃GSH的产量下降了。这表明，在37℃谷胱甘肽合成酶具有最大活性。如有机会可进行37℃—50℃之间的温度试验，以寻找更精确的温度点。编号pH1pH2pH3pH4pH6.57.07.58.2A3050.6440.6890.7320.301C(mg/L)158.7169.93180.65172.92编号T1T2T3T4T(℃)28303750A3050.7680.8070.8730.801C(mg/L)169.6199.4215.8197.9表.2温度上升对GSH产量的影响Table.2Effectofincreased