超好研究生分子生物学课件-第九章 基因和基因功能分析基本策略07

目录高等教育出版社1南昌大学医学院万福生第九章基因和基因功能分析的基本策略目录高等教育出版社2由于基因克隆技术可以扩增特定基因片段，使基因分析可以在体外或用各种动物模型得以实现。当前被称为医学研究的“活试管”的转基因动物和基因敲除动物两种模型的建立，其前期工作都是要构建基因载体。可见，基因克隆在基因研究中的重要性。分析基因可在DNA，RNA和蛋白质三个层面上进行，研究者应根据研究目的筛选适当的实验方法和制定研究技术路线。基因分析是一种策略性非常强的工作，能用于基因分析的实验技术和方法很多，选择适当的实验方法和切入点是基因分析首先要考虑的，即要有一个周密的基因分析的策略。目录高等教育出版社3一、基因分析的基本策略(一)利用DNA定性定量分析研究基因1.DNA序列测定基因的一级结构变化人类基因组包含着决定一个人生,老,病,死及精神,行为等活动的全部遗传信息.基因或基因组变异是人类多种疾病的根本病因,揭示基因或基因组的结构变化是推动医学向纵深发展的关键.也是揭示生命起源与进化,细胞生长与分化,疾病发生与发展的分子机制.DNA序列测定常用于鉴定基因或基因组的变异.目录高等教育出版社4核酸序列分析的基本原理化学裂解法(Maxam-Gillbert法)DNA链的末端合成终止法(sanger法)目录高等教育出版社5A、化学裂解法(Maxam-Gillbert法)基本原理基于某些化学试剂可以使DNA链在1个或2个碱基处发生专一性断裂的特性，精确地控制反应强度，使一个断裂点仅存在于少数分子中，不同分子在不同位点断裂，从而获得一系列大小不同的DNA片段，将这些片段经电泳分离。分析前，用同位素标记DNA的5´末端，经放射自显影即可在X胶片上读出DNA链的序列。目录高等教育出版社6B、DNA链末端合成终止法目录高等教育出版社7目录目录高等教育出版社8C、DNA自动测序采用荧光替代放射性核素标记是实现DNA序列分析自动化的基础。用不同荧光分子标记四种双脱氧核苷酸，然后进行Sanger测序反应，反应产物经电泳（平板电泳或毛细管电泳）分离后，通过四种激光激发不同大小DNA片段上的荧光分子使之发射出四种不同波长荧光，检测器采集荧光信号，并依此确定DNA碱基的排列顺序。目录高等教育出版社9DNA自动测序结果举例目录目录高等教育出版社102.基因拷贝数变化的分析方法用Southerblot分析基因拷贝数此法通常只能分析已知基因的拷贝数.其成功与否的关键在于适当的DNA酶切消化和基因探针的标记.采用PCR技术分析基因拷贝数一般说来,传统PCR不合用于分析基因拷贝数变化,但差异PCR和实时PCR(real-timePCR)可以用于基因拷贝数的分析。有时也可通过对PCR产物含量的多少估计基因拷贝数在不同个体之间的差异，一般常用actin等管家基因作内参照。目录高等教育出版社11Southernblot的基本过程目录高等教育出版社12Northernblot的基本过程目录高等教育出版社13Westernblot的基本原理目录高等教育出版社14三种印迹技术的比较目录高等教育出版社15实时PCR技术原理目录目录高等教育出版社16用原位杂交技术确定基因在染色体上的分布首次将原位杂交(insituhybridization,ISH)技术用于基因定位是1977年,用此法确定了人α和β珠蛋白基因分别在11和16号染色体上的位置.荧光原位杂交(fluorescenceinsituhybridization,FISH)是用特殊荧光标记DNA探针,可在细胞、染色体及组织切片上检测细胞内是否存在特定的DNA或RNA序列，其分辩率小于100kb。目录高等教育出版社17(二)RNA定性定量分析观察基因表达活性1.Nothernblot分析基因转录水平Nothernblot是定性分析mRNA水平的常用方法，也可相对定量分析特定RNA。其基本程序与Southerblot相似。RNA样品制备和电泳分离成为关键步骤，操作人员的实验技巧是实验成功与否的重要因素之一。现都倾向用RT-PCR方法。目录高等教育出版社182.RT-PCR分析基因转录水平通过RNA的分析,一是可以确定基因表达的组织分布;二是可以确定基因的表达时相。前者是用Nothernblot技术，对不同组织来源RNA进行定性杂交检测，以确定特定基因的组织分布。后者是分析同来源的组织细胞在不同培养时间中RNA的表达特点。目录高等教育出版社193.RNA酶保护实验基因转录后的RNA剪接可以直接影响基因活性,使一个基因产生多条多肽链或蛋白质产物。RNA酶保护实验(RNaseprotectionassay,PRA)是一种液相RNA杂交技术，主要是用RNaseA和RNaseT1专一性降解单链RNA，分析受保护的杂交双链RNA，从而确定RNA是否剪接、剪接种类、剪接位点及内含子的可能位置等。PRA的基本程序主要包括待测RNA的分离、RNA探针的制备、待测RNA与RNA探针的液相杂交和RNA酶消化等。目录高等教育出版社204DNA芯片(DNAchips)技术DNA芯片是生物芯片(biochip)中的一种,又称基因芯片、DNA阵列(DNAarray)、cDNA芯片等。生物芯片是指通过微电子、微加工技术在芯片表面形成的微型生物化学分析系统，以实现对细胞DNA、蛋白质及其它物质高效、敏感而又快速的处理。biochip又分为DNA芯片、蛋白质芯片及其它芯片三类。目录高等教育出版社21DNA芯片技术分析基因转录活性的原理与核酸分子杂交方法是一样的，都是用已知核酸序列与靶核酸序列杂交，定性定量分析基因表达情况，但不同的是DNA芯片表面集成了大量的核酸分子探针，能在同一时间内平行分析大量的基因转录产物。DNA芯片技术还可用于基因组研究、基因诊断、法医鉴定及药物研究等。目录高等教育出版社22目录目录高等教育出版社23(三)蛋白质定性定量分析揭示基因表达活性1.Westernblot分析特定蛋白质Westernblot是用于分析克隆基因表达产物分析最特异的方法，也是首选方法。其基本步骤包括：样品蛋白质的制备、SDS-PAGE分离、蛋白质的转膜、特定抗体与膜上相应蛋白杂交及检测分析标记信号。如目的基因表达活性较低，一般需采用免疫沉淀技术对目的蛋白进行浓缩，然后进行Westernblot。目录高等教育出版社24Westernblot的基本原理目录高等教育出版社252.荧光激活细胞分拣分析特定蛋白质荧光激活细胞分拣(fluorescence-activatedcellsorting,FACS)技术，又叫流式细胞术(flowcytometry)，是近年发展起来的一种快速定量分析细胞的新技术，用于细胞表面分子表达的定量分析，即可用于活细胞表面特定基因表达产物的定量分析。因此，该技术可用于基因表达活性的分析。如绿色荧光蛋白(greenfluorescenceprotein,GFP)基因，使转染成功的细胞在表达外源基因的同时表达GFP，利用GFP的绿色荧光，可用流式细胞仪进行检测。3.免疫组化对细胞内蛋白的定位和半定量分析目录高等教育出版社26二、基因功能分析的基本策略随着人类基因组计划(HGP)的完成，人们对未知基因功能的预测和研究成为21世纪的热点之一，其主要任务就是在基因组上找出每项个基因和基因产物及其的功能。制定合适的分析策略是进行基因功能分析的重要步骤。基因功能分析可以在DNA、RNA和蛋白质水平上采用不同的技术和模型来进行，转基因小鼠和基因敲除小鼠是当前研究基因功能最常用的动物模型。下面简要介绍几种用于基因功能分析的常用技术方法。(一)采用转基因模型研究基因功能(二)采用基因敲除动物模型研究基因功能(三)采用转录后基因沉默或抑制研究基因功能目录高等教育出版社27(一)采用转基因模型研究基因功能研究基因功能的转基因模型目前主要有动物模型和细胞模型两种。转基因小鼠模型是应用最多的转基因动物模型。1.利用转基因动物研究基因在体内的功能转基因动物(transgenicanimal)是指用人工方法(转基因技术)将外源基因导入或整合到基因组上，培育出带有外源基因并能稳定表达的动物。其中将外源基因导入或整合到基因组上的过程称转基因(transgene)。上述这种能够产生转基因动物的方法称转基因技术(transgenictechnology)。目录高等教育出版社28第一次获得了转基因小鼠是1982年。由美国科学家Brinster和Palmiter将大鼠生长激素基因(GH)与小鼠的金属硫蛋白基因(MT)连在一起，构成MTrGH融合基因，然后用显微注射法注射到小鼠受精卵中，再移植到假受孕的子宫中，待其发育生长。这次共产了21只小鼠，其中7只带有GH基因，而6只的体形较原小鼠大一倍左右，即称超级小鼠或巨型鼠。转基因小鼠模型是医学领域中应用最广泛的动物模型。导入外源基因的方法主要有显微注射法、胚胎干细胞法及逆转录病毒法等。目录高等教育出版社29目录目录高等教育出版社30目录高等教育出版社31显微注射法的特点：经此法注射的受精卵的成活率约有60%，由此发育所得的小鼠中大约有10-40%带有外源基因，其中80%的基因整合发生在单细胞期，成为转基因动物。另外20%在细胞分裂后发生整合，这部分动物并不是所有细胞中都带有外源基因，这类动物称嵌合动物(chimericanimal).外源基因整合的拷贝数从1-几百不等，一般是在染色体单个位点整合，偶尔有在不同染色体不同位点整合。外源基因可几个片段首尾相连插入整合位点。此技术的优点：导入基因的速度快、操作简单、对DNA大小无限制（可达200kb以上）。目录高等教育出版社32胚胎干细胞法导入基因的基本过程目录高等教育出版社33核转移技术的基本原理目录高等教育出版社34转基因动物的应用我国的转基因研究虽起步较晚，但进展较快，已经成功制备了转基因大鼠、小鼠、牛、羊、兔子、猪及鱼等。转基因研究的应用主要有以下方面：①研究组织细胞基因的特异表达；②研究外源基因的新表型，发现基因新功能；③研究外源基因插入后的突变表型，发现新基因；④建立研究外源基因表达、调控的动物模型；⑤培育动物新品种；⑥制备基因产品；⑦建立人工的疾病动物模型。目录高等教育出版社352.利用细胞模型研究特定基因的功能在细胞水平上进行转基因，以建立基因转染细胞模型，可在DNA、RNA及蛋白质水平上研究特定转染基因的功能。转染细胞是研究基因功能的常用细胞模型。利用转染细胞研究基因功能时，可在细胞水平上进行，也可在动物体内进行，如将转染某一抑癌基因的肿瘤细胞接种到小鼠体内。目前许多基因工程的重组蛋白的功能研究都采用转染细胞模型。目录高等教育出版社36(二)采用基因敲除动物模型研究基因功能研究基因功能最直接的方法就是在被研究的动物基因组中剔除这个基因。基因敲除(geneknockout)是指通过DNA同源重组定向地将外源基因插入宿主细胞染色体中，使某特定基因在细胞或活体内失活的过程。它是目前在体内研究基因功能的最好方法。基因敲除动物(geneknockoutanimal)是指通过同源重组定向地在活体内剔除特定基因的动物。基因敲除小鼠是指在两条染色体上的等位基因都失去功能的小鼠。目录高等教育出版社37(三)采用转录后基因沉默或抑制研究基因功能1.利用RNA干扰技术研究基因功能RNA干扰(RNAinterference,RNAi)是指由短双链RNA诱导的同源mRNA的降解过程。RNA干扰过程主要分两个阶段：一是siRNA的生成，二是siRNA与细胞内某些酶或蛋白质形成RNA诱导的沉默复合体(RISC),RISC可识别与siRNA有同源性的mRNA，并在特异彩位点切割该mRNA。2.利用反义RNA抑制基因表达与mRNA互补结合的RNA分子称为反义RNA(antisenseRNA)。反义RNA与mRNA结合形成局部双链，阻碍了蛋白质的合成。目录高等教育出版社38反义RNA具有抑制特定基因表达的活性能，一些公司将反义RNA制成药物用于治疗肿瘤，如用bcl-2基因的反义RN