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转基因动物本章内容•9.1转基因的方法和原理•9.2转基因动物•9.3转基因植物•9.4转基因生物和生物安全性9.1转基因的方法和原理•9.11目的基因制备和载体系统•9.12几种有效的转基因方法•9.13定点突变和受体系统简介•转基因研究技术的中心环节即为DNA重组技术，其最终目的是将DNA片段转入为一个生物体，从而使该生物体具有表现某种性状。•转基因通过获取基因、重组基因和表达基因等过程来实现。•转基因打破了物种的界限，使不同种的生物的遗传物质在分子水平上重新组合在一起，并且完全可以按照人的意志或目的，实现对生物体的改造。基本步骤•1.分离获得目的基因；•2.在体外进行DNA重组，将外源DNA连接到能自我复制又带有选择标记的载体上；3.将重组DNA转移入受体细胞；•4.筛选出含有目的DNA的受体细胞克隆；•5.将此克隆。9.11目的基因制备和载体系统•目的基因来源：基因组DNA分离、化学合成、PCR扩增、cDNA文库及DNA文库中制得。•载体：质粒、λ噬菌体、柯氏质粒、YAC载体等•工具酶：限制性内切酶、连接酶、DNA聚合酶等PCR反应•PCR技术就是在体外通过酶促反应或自发地扩增一段目的基因的技术。•PCR要求反应体系具有以下条件：•1、要有与被分离的目的基因两条链各一端序列相互补的DNA引物(约20个碱基左右)；•2、具有热稳定性的酶如TaqDNA聚合酶；•3、4种dNTP；•4、作为模板的目的DNA序列。•PCR反应可扩增出100～5000bp的目的基因。PCR反应过程•1、变性，即将模板DNA置于95℃的高温下，使双链DNA的双链解开变成单链DNA；•2、退火，将反应体系的温度降低至55℃左右，使得一对引物分别与变性后的两条模板链相配对；•3、延伸，将反应体系温度调整到TaqDNA聚合酶作用的最适温度72℃，然后以目的基因为模板，合成新的DNA链。•反复进行约30个循环左右，即可扩增得到目的DNA序列。利用cDNA法•由于真核生物的mRNA具有polyA这一结构特点，可以用结合长度大约为15bp的短链多聚DT的纤维素填充的柱子，根据碱基配对原则，将其吸附，从真核细胞的总RNA中提取出来，再用能打断A-T氢键的缓冲液洗脱。•在mRNA群体中，有高丰度的mRNA，拷贝数多；也有低丰度的mRNA，但种类多，高丰度的mRNA容易合成cDNA。•要保证构建的cDNA文库中要含有目的克隆，可利用琼脂糖凝胶电泳、非变性蔗糖梯度离心和羟甲基蔗糖剃度离心等分级分离不同长度的mRNA，也可以利用cDNA的大小分级分离。cDNA链的合成•得到纯化的mRNA后，再利用逆转录酶和DNA聚合酶I，缓冲液和4种脱氧核糖核苷三磷酸及短的digo（dT）分子作为引物，合成cDNA。•这些cDNA是由该种生物的各种mRNA分子逆转录得到的，因此是混合物，它们可以通过末端连接或是加入衔接物等其它方法克隆进入质粒载体，形成cDNA文库。•然后，采用DNA杂交或免疫分析的方法来筛选目的基因质粒载体•质粒（plasmid）是能自我复制的双链环状DNA分子，它们在细菌中以独立于染色体外的方式存在，其大小不定，小的不到1kb，大的超过500kb。•每个质粒都有一段DNA复制起始位点的序列，它能帮助质粒DNA在宿主细胞中复制。•高拷贝数的质粒，在宿主细胞中能达10～100个拷贝；低拷贝数的质粒，在宿主细胞中只有1－4个拷贝。•质粒要成为克隆载体，就必须进行遗传改造，使之成为一个具有单一的限制性内切酶识别位点、多个选择性标记、并一般小于15kb且以高拷贝数存在的克隆载体。其最大可以克隆的DNA片段一般在10kb左右。质粒载体pBR322•1.大小为4361bp，含有抗氨苄青霉素和抗四环素这样两个抗生素抗性基因•2.在四环素抗性基因内部，还具有BamHI、HindⅢ和SalI三个识别位点。•3.PstI识别位点在氨苄青霉素抗性基•4.pBR322带有一个复制起点，可以保证质粒只在大肠杆菌里进行复制功能。pUC19质粒•长2686bp，带有pBR322的复制起始位点，一个氨苄青霉素抗性基因和一个大肠杆菌乳糖操纵子β－半乳糖苷酶基因（lacZ’）的调节片段，一个调节lacZ’基因表达的阻碍蛋白的基因lacI，还有多个单克隆位点。•pUC19的筛选将转化细胞涂布到含有氨苄青霉素、IPTG和X－gal的固体培养基上，那些带有自身环化质粒的细胞由于能够形成具活性的β－半乳糖苷酶，所以菌落是蓝色，如果插入有目的DNA片段，无法形成杂合β－半乳糖苷酶，菌落时白色的。λ噬菌体•λ噬菌体染色体是长约49kb的双链DNA，该DNA的两个5’末端都是由12个bp组成的单链互补粘性末端，当λ噬菌体DNA进入宿主细胞后，这两个粘性末端互相结合，在连接酶作用下封闭成环•在λ噬菌体基因组中位于左边的基因（A-J）编码噬菌体头部和尾部的蛋白质，中间的基因（J-N）与重组和生长过程有关，但与裂解生长过程无关，因此对裂解生长过程来说，中间区的DNA是非必需的，可以被缺失或置换，因此可以在这个区域克隆外源DNA，右边的基因涉及λ基因的表达、调节、DNA合成晚期功能调节以及宿主细胞裂解等。λ噬菌体载体•分类：插入型载体和置换型载体。•插入型载体：具有单一的酶切位点，可供外源DNA的插入。•置换型载体：有成对的酶切位点，在两个酶切位点之间的DNA片段，可被外源DNA片段置换。•λ噬菌体载体可以克隆较大DNA片段，最大长度约为24kb，只需将λ噬菌体DNA、尾巴和纯化的空的头，混在一起就可以在体外产生具有侵染性的噬菌体颗粒。柯氏质粒Cosmid•柯氏质粒可克隆携带40kb大小的DNA片段，并在大肠杆菌中复制保存，综合了质粒载体和噬菌体载体二者的优点。•柯氏质粒上带有多个单克隆位（RE2），两个cos位点，DNA复制起始位点和抗生素抗性基因，在两个cos位点之间还有一个限制性内切酶位点（RE1）。9.12几种有效的转基因方法•基因转移（transgenosis）是借助于物理、化学或生物的手段将外源基因导入受体细胞，并检查其在该细胞内表达情况的一种技术，是细胞工程中一项重要而应用广泛的技术。•细胞直接摄取外源DNA的过程称为转化（transformation），如果通过噬菌体的释放和感染将DNA从一个细胞转移到另一个细胞的过程，称为转导(transduction基因转移的方法1.细胞融合10－62.微细胞介导的基因转移≤10－63.染色体介导的基因转移10－64.脂质体介导的基因转移≈2×10－45.磷酸钙沉淀物介导的基因转移10－3－10－76.显微注射DNA≈1－10％7.电脉冲介导的基因转移10～30％8.激光，超声波介导的基因转移10～50％9.重组RNA病毒感染≈10～100％10.重组DNA病毒感染≈100％DNA-磷酸钙沉淀法•磷酸钙沉淀反应是将外源DNA转移并整合到细胞株中去的最常用方法，主要用于将基因导入动物细胞。•由于核酸以磷酸钙－DNA共沉淀物的形式存在，培养细胞对DNA的吸收会大大提高，细胞通过内吞作用，使DNA进入细胞质，并转移整合到细胞核内的染色体内。•一般是将DNA与CaCl2溶液混合后，同时加入HEPES缓冲的盐溶液（HeBS）混合，静置后形成DNA－磷酸钙沉淀物，然后用来转染受体细胞。这个过程中，pH值、Ca2＋浓度等都会对转染的效率有所影响。方法简单，效率较高，可达培养细胞的20％，但缺点是受体细胞有限。脂质体（liposome）介导的基因转移•脂质体是一种内部包装DNA的球状磷脂双分层膜结构，能与细胞膜融合将DNA送入细胞的。•用脂质体介导DNA转染各种不同的类型的真核细胞的方法具有较高的转化效率和可重复性。•脂质体制备的基本方法是以一定比例称取磷脂酰胆碱和磷脂酰丝氨酸，放于氯仿中之后加入待转移的DNA分子制成悬液，经超声化处理后，即形成包含DNA分子的脂质体，然后与培养细胞作用2小时左右，就可望实现DNA导入受体细胞。•脂质体介导的基因转染率受脂质体的组成及理化性质的影响。•脂质体可以实现体内和体外的瞬时稳定表达。显微注射DNA•显微注射DNA一般是用微吸管加DNA溶液在显微镜下准确地插入受体细胞核中，并将DNA注射进去的方法，在动物细胞转移中较常使用。现在，多利用显微镜操作器在相差显微镜下进行操作。每个细胞的注射量约为10－11ml，熟练的操作者每10分钟可注射200个细胞。显微操作仪显微操作仪的使用•显微操作仪使用杠杆操作而移动，它能靠杠杆操作把微吸管的先端在显微镜的视野中作平面移动。上下的运动靠设在显微操纵仪支柱上的上下微动，粗动调节装置进行。它与显微镜牢固地连接起来。右侧的显微操作仪是装在显微镜本体上，左侧的显微操作仪是装在显微镜的机械台上，随机械台的移动而移动，一般在进行操作时，先将平皿放置在显微注射仪上，移动载物台，把视野移到细胞处，先用缓慢移动显微操纵仪上固定细胞的微吸管，同时使注射器缓慢减压，吸引目标受精卵并固定之，再用另一侧显微操纵仪移动微注射针，对准细胞核刺入，导入目的基因，完成显微注射。显微注射法的优点•1）转化率高达20％，特别是在没有合适的DNA载体系统时更有价值；•2）对各种受体细胞均适用，从体细胞、淋巴细胞到受精卵；3）对转移物质没有限制，可以是DNA、RNA、蛋白质、病毒、代谢物或代谢底物以至细胞器、染色体、细胞核；•4）可以控制转移的量和转移物的浓度；•5）可选择受体细胞的核的接受位点，可研究物质在细胞内的运转，区隔化和依赖区隔的修饰；•6）受体不用特殊的选择系统；•7）要求的样品量少，2ml样品足够作显微注射；•8）实验细胞与对照细胞可以化同样的条件下比较。但也有缺点，如设备和技术的要求较高，一次处理细胞数量不能太多，对细胞有损伤基因枪介导的DNA转移•基因枪法最早是由美国康奈尔大学的Sanford最先提出的。它通过高速飞行的金属颗粒将包被其外的目的基因直接导入到受体细胞内，从而实现基因转化的方法。1992年，世界首例转基因小鼠就是通过该法获得的。基因枪转化的原理决定基因枪使用成功的因素•第一因素是动力系统。•根据动力系统，基因枪分为三大类：一类是以火药爆炸力作为动力加速微弹；第二类是以电弧放电蒸发浪作为动力；第三类是以高压气体作为动力。•第二因素是微弹的制备过程。用的微载体有两类：一是钨粉，另一个是金粉，直径一般为0.6－4μm。•常用的将DNA包被到微载体上所用的沉淀试剂有亚精胺、氯化钙、乙醇、聚乙二醇、异丙醇等。•第三个因素是受体材料的选择。•基因打靶（genetargeting）又称同源重组技术，也是转基因技术的一个组成部分•利用转基因的方法，将外源基因序列导入靶细胞后，通过外源基因序列与靶细胞内染色体上同源基因序列间的重组，将外源基因定点整合到靶细胞基因组上的某一确定位点，而对某一预先确定的靶位点进行点突破的一项技术。9.13定点突变和受体系统基因敲除的载体•O型载体，又称序列插入型载体，这类载体与靶基因组同源重组配对，经过一次交换，前者插入后者，它发生单交换而将载体序列插入靶基因内，致使染色体DNA部分重复，可能破坏内在正常基因而发生突变，也可代替原来缺陷基因，纠正遗传特征，使靶基因特异失活。•Ω型载体，也称序列取代载体，外来载体DNA和靶细胞染色体DNA同源配对，经过两次交换，前者取代后者，此类载体可与靶序列发生双交换，以外源序列取代靶序列，其基因组大小并无改变。靶细胞•基因敲除的靶细胞既可以是原核细胞，也可以是真核细胞；既可是植物细胞，也可是动物细胞。对于单细胞生物和体细胞具有全能性的植物来所，对靶细胞选择要求不高，对任一细胞打靶成功都可获得纯系个体。但对于动物，普通细胞敲除却无法得到纯系个体，小鼠生殖系嵌合体构建技术的发展却提供了理想的胚胎干细胞靶细胞。•胚胎干细胞体积大，胞浆少；体外培养时，细胞排列紧密，呈集落形生长，在集落边缘有时可见有少量的已分化细胞，形态为扁平上皮细胞样或梭形成纤维细胞样。转入方法•构建的基因敲除载体，经线性化后通常采用电穿孔的方法将DNA引入胚胎干细胞。一般电压为220～80