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实验一培养基的制备与灭菌技术一、试验原理马铃薯中含有淀粉、蛋白质、脂类及多种维生素经煮沸后可把这些营养成分从中溶出以供酵母和霉菌生长需要，加入葡萄糖或蔗糖以补充微生物所需的碳源。此培养基为半合成培养基。二、实验目的：1、掌握培养基的制备方法，2、学会高压蒸汽灭菌技术。三、实验材料和仪器：1、马铃薯、葡萄糖（或蔗糖）、琼脂。2、烧杯、漏斗、试管、三角瓶、量筒、玻璃棒、纱布、棉花、细绳、牛皮纸、试管架、培养皿。3、手提式高压蒸汽灭菌锅、天平、电炉。四、实验方法与步骤：（1）选无芽、无腐烂的马铃薯、洗净、削皮、称40g切碎加水200ml,放入1000ml烧杯中煮沸0.5hr、冷却用纱布过滤去渣。（2）在清液中加入4g葡萄糖溶解补水至200ml，此时到入一试管10ml。余下溶液加3.8g琼脂加热熔化。（3）试管分装：取玻璃漏斗装在漏斗架上，漏斗下连一橡胶管，与玻璃管嘴相接，橡皮管上夹一弹簧夹，培养基倒入漏斗，通过弹簧夹控制培养基的流量。（4）余下的培养基分装在两个250ml的三角瓶中。（5）高压蒸汽灭菌：把溶解完的培养基用棉塞塞上并用牛皮纸把棉花包住，在121℃，0.1Mpa下灭菌20min即可，灭菌时要注意放净阀气。取出灭菌物品时一定要等到压力降到零时打开灭菌锅盖。（6）斜面摆放：将分装灭菌后的琼脂培养基试管置于水平放置的试管上，凝固后即成斜面。（7）培养皿培养基的倾倒：先用酒精棉球擦拭桌面及双手,在靠近酒精灯火焰的上方把冷却到45℃左右的培养基倒入培养皿内，每只倒入15ml左右。注意：温度太低培养基会凝固。五、思考题：1．培养基配制好后为什么要灭菌？2．蒸汽灭菌应注意几个问题？为什么？实验二微生物接种和无菌操作技术一、实验目的1、了解无菌操作在微生物接种过程中的重要性，掌握无菌操作的基本环节。2、掌握几种常用微生物的接种方法，为微生物的形态观察作准备。二、实验材料1、菌种（1）细菌大肠杆菌（Escherichiacoli），枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）,(2)酵母酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）,(3)霉菌黑曲霉（Aspergillusniger）2、培养基（1）肉汤培养基固体斜面培养基，液体培养基，半固体培养基，固体培养基。（2）PDA培养基液体培养基，斜面培养基，固体培养基。3、接种工具接种针，接种钩，接种环。4、酒精灯，标签纸，火柴，镊子，75%酒精棉球，试管架，电炉，铝锅，无菌平皿。三、实验方法与步骤1、斜面接种用接种环在肉汤斜面培养基上划密波蜿蜒曲线接种大肠杆菌和枯草芽孢杆菌，在PDA培养基斜面上用划直线和点接的方法分别接种酵母菌和霉菌。2、液体接种：用接种环在肉汤培养基液体中接种细菌，在PDA液体培养基中接种酵母菌。液体接种时取一环菌苔，沿管壁轻轻擦下菌苔，塞上棉塞轻摇试管。3、穿刺接种：在肉汤培养基上接种细菌，在PDA培养基上接种酵母菌。4、平板接种：分别在不同的培养基平板上点接不同的菌种。四、结果记录1、斜面接种（1）检查斜面接种情况、绘制斜面生长草图。（2）分析斜面接种好坏的原因（3）保留斜面、以便观察形态时使用。2、液体接种观察记录细菌、酵母的液体培养特征，保留酵母液体培养液备用。3、穿刺接种（1）检查穿刺接种效果，绘制草图。（2）叙述不同微生物穿刺培养后的现象及原因。（3）分析穿刺接种好坏的原因。4、平板接种（1）检查平板接种的生长状况，有无污染（凡没接种地方长出菌落均为染菌）。（2）描述各个菌落的特征。实验三显微镜的使用、微生物观察和菌体大小测定一、实验原理应月显微镜的成像原理，同时借助显微镜的镜台测微尺和目镜测微尺，两尺配合使用，进行测量和运算，得出细胞的大小。镜台测微尺系一特制的载玻片（图1－3），它的中央是一具有刻度的标尺，全长为1mm，共划分为10大格，每一大格又分成10小格，每一小格长0.01mm，即10um。也有全长为2mm，共分200小格，每小格的长度不变。在标尺的外围有一小黒环，以便找到标尺的位置。图1－3镜台测微尺目镜测微尺是放在目镜内的一种标尺，它有固定式和移动式两种类趔。固定式目镜测微尺为一块圆形玻璃片，直径为20～21mm，如图1－4所示。在它的上面刻有各种形式的标尺，有为直线式的（图1一4A），有为网式的（图1—4B）通常用以测量长度的标尺为直线式的，一般为5mm，分成5大格，每一大格分成10小格，共计50小格。也有用同样长度分为100小格的。网式目镜测微尺主要用以计算数目和测量物体的面积。在它上面刻有方格的网状标尺。方格的大小和数目各有不同，有25、36和49格，也有的一个正方形大格中划分100个方格，在中央的一个方格中再划分25个小方格。图1－4目镜测微尺A.直线式B.网式C.移动式（外形）D.移动式（内部）移动式目镜测微尺基本上和直线式目镜测微尺相似，所不同的是除了泣种固定的标尺外，还有可以移动位置的指示线。它装在一个特别的目镜中．右边由一个能旋转的小轮控制着，轮上有刻度，分成100格，该轮每旋转一圈，目镜内能移动的指示线就从标尺一端向另一端移动－格。显微测量时，先用镜台测微尺标定目镜测微尺每小格代表的长度，然后才能用目镜微尺来测量细胞的长度。二、实验目的：1、学会测微尺的使用和计算方法。2、掌握酵母菌细胞体积的测定方法三、实验材料和仪器：1．菌种酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）上次实验的液体培养物2．盖玻片、载玻片、显微镜、镜台测微尺、目镜测微尺、酒精灯、生理盐水、吸水纸。3．擦镜纸、滤纸条、镊子、无菌吸管、酒精棉球。四、实验方法与步骤测微尺的使用操作1、卸下目镜的上透镜．将目镜测微尺有刻度一面向下装在回镜镜面上，再旋上目镜上的透镜。2、将镜台测微尺有刻度的一面朝上放在载物台上夹好，使测微尺刻度位于视野中央。调焦至能看清镜台测微尺的刻度。3、小心移动镜台测微尺和目镜测微尺（如目镜测微尺刻度模糊，可转动目镜上透镜进行调焦），使两尺左边的“0”点直线重合，然后由左向右找出两尺另一次重复的直线（图1－5）。4、记录两条重合线间目镜测微尺和镜台测微尺的格数。按下式计算目镜测微尺每格的长度等于多少um目镜测微尺每格的长度（um）＝镜台测微尺的格数目镜测微尺的格数X10ABCD图l—5目镜测微尺的标定上，目镜测微尺；下，镜台测微尺例如，图1－5中，在低倍镜下所标定的目镜测微尺的全长（50格），等于镜台测微尺70格，则目镜测微尺每小格代表的长度则为：取下镜台测微尺，换上要测量的玻片标本，用目镜测微尺测量细胞长度的格数，乘以每格的um数，即为细胞的实际长度。如用不同倍数的物镜与目镜时，就需重新计算，方法同前。在测量时应注意将被测量的标本移到视野中心，因为在这个位置上镜像最清晰．像差也最小，为减少误差．在测量同一物体时，要重复3次以上，再取其平均值．还需注意视野中的亮度应均匀一致，以免影响测量值的准确性。根据长度测量结果可计算细胞的体积。公式如下：椭圆形V＝4лab2/3（a,b为长短轴的半径）圆球形V＝4лr3/3（r为半径）5、酵母菌大小的测定（1）取下镜台测微尺，换上酵母菌水浸片。（2）测量菌体的长轴和轴各占目镜测微尺的格数，然后换算出菌体的实际长度。（3）在同一标本上测量5~10个酵母细胞，取其平均植。6、酵母菌体积的测定用显微测微尺测量并换算出酵母菌的长轴和短轴的实际长度后，代入公式求出酵母菌的体积V。五、实验结果1、在低倍镜下：目镜测微尺（）格＝镜台测微尺（）格，目镜测微尺每小格＝（）um;2、在高倍镜下：目镜测微尺（）格＝镜台测微尺（）格，目镜测微尺每小格＝（）um。3、酵母细胞长=目镜侧微尺（）格=（）微米。酵母细胞宽=目镜侧微尺（）格=（）微米。酵母菌细胞体积=（）um3。六、思考题1、为什么采用不同放大倍数目镜和物镜时，必须重新用镜台测微尺对目镜测微尺进行标定？0123450.00.10.20.30.40.60.50.70.80.91.0目镜测微尺每格的长度（um）＝7050X10＝142、若目镜不变，目镜测微尺也不变，只改变物镜，那么，目镜测微尺每格所测量的酵母的实际长度（或宽度）是否相同？为什么？实验四酵母菌细胞计数法及酵母出芽率的测定一、实验目的：1、了解血球计数板的构造和使用方法。2、学习并掌握利用血球计数板对酵母菌细胞数进行测量和酵母出芽率的测定。二、实验材料和仪器：1、菌种酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）上次实验的液体培养物2、盖玻片、载玻片、显微镜、血球计数板、酒精灯、滤纸条、无菌吸管、酒精棉球、擦镜纸等。三、实验方法与步骤：1.血球计数板的构造:测定微生物生长量的方法很多，对酵母来说有两大类：总菌计数和活菌计数，分别称为直接和间接法。总菌计数是利用血球计数板在显微镜下直接计数，立即得到数值，是死细胞和活细胞的总和；活菌计数是计算活菌在平皿上形成的菌落数，费时较长。本实验利用血球计数板对酵母直接计数，计数的同时统计出出芽率。血球计数板由四条平行槽而构成三个平台，中间平台较宽，并分为两部分，每部分均刻有长和宽各1mm的方格网，中间平台下陷0.1mm，故盖上盖玻片后计数室的体积为0.1mm3。常用血球计数板有两种规格。一种16x25型，称为麦氏血球计数板，共有16个大格，每个大格又分为25个小格；另一种是25x16型，称为希里格式血球计数板，共25个大格，每一大格又分为16个小格。无论是哪一种血球计数板，都有一共同特点，即计数室的小格数相同，均为400个。其结构见下图。0.01mm1/400mm2XB-K-25计数板盖玻片中央平台麦氏血球计数板希里格式血球计数板2.酵母菌细胞计数：(1).检查血球计数板是否有杂质和菌体，若有用脱脂棉蘸取95%酒精轻轻擦洗计数板的计数室，用蒸馏水冲洗计数板，用滤纸吸干其上水分，勿用火烤，最后用擦镜纸揩干净。(2).样品稀释：稀释的目的在于便于计数，稀释要求每小格内4—5个细胞，一般稀释10倍。（3）加样：先将盖玻片置于计数室上，用吸管吸取一滴稀释好的菌液滴于盖玻片边缘，让菌液自行渗入，多余的菌液用滤纸吸去，稍待片刻，待酵母细胞全部沉降到计数室底部在进行计数。(4).计数将加好样品的计数板放到显微镜载物台中央，按下列步骤寻找计数室并计数。①找计数室先用低倍物镜寻找到大方格网位置。寻找时，显微镜的光圈要适当缩小，使视野偏暗，然后顺着大方格移动计数板，使计数室位于视野中间。②转换高倍镜转至高倍物镜后，适当调节光亮度，使菌体和计数室线条清晰，然后将计数室一角的小格移至视野中。③计数16x25型取左上、右上、左下、右下四大格共100小格内的细胞逐一进行计数；25x16型取左上、右上、左下、右下和中间五大格共80小格进行计数，计数时遇到位于大格线上的酵母菌时，只计大格上方及右方线上的细胞（或只计下方及左方线上的细胞），将细胞数填入格中对每个样品重复三次，取平均值，计算酵母菌细胞数。（5）计算公式：25x16:细胞数/ml=(80小格细胞总数÷80)x400x10x1000x稀释倍数16x25:细胞数/ml=（100小格细胞总数÷100）x400x10x1000x稀释倍数(6)清洗计数板使用完毕后，用蒸馏水冲洗，绝不能用硬物洗刷，，洗后待其自行晾干或用滤纸吸干，最后用擦镜纸揩干净。若为病原菌，则浸泡在5%石炭酸溶液中消毒后再清洗。3.酵母出芽率的测定：（1）同上步骤数出酵母的出芽数并填在上面表格中（一般需平行计数三次）。（2）观察酵母菌出芽率时，遇到芽体大于细胞本身50%时不作为芽体计数，而作为酵母数计数。（3）计算公式：酵母出芽率=（芽体数÷酵母菌细胞总数）x100%四、实验结果细胞总数测定表格：计数次数各大格中的细胞数大格中细胞总数稀释倍数细胞浓度（个/ml）芽体数左上右上右下左下中间第一次第二次第三次平均值三次测定结果：每毫升菌液中酵母细胞数平均值________。酵母细胞出芽率的测定计算次数总酵母细胞数芽体数出芽率（%）第一次第二次第三次三次测定结果平均值：出芽率_______%五、思考题：1、试述计数板的计数原理。为什么