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纳纳纳纳米米米米沸沸沸沸石石石石修修修修饰饰饰饰微微微微通通通通道道道道反反反反应应应应器器器器内内内内固固固固定定定定化化化化酶酶酶酶催催催催化化化化的水解的水解的水解的水解反反反反应应应应动动动动力力力力学学学学学生姓名：***专业：生物工程学号：……论文简介通过在毛细管内层层组装纳米沸石并固定脂肪酶来构建纳米沸石修饰的固定化酶微反应器通道，将纳米沸石良好的生物相容性和高的酶固定能力与微反应器反应效率高和扩散传质快等优点相结合，以对硝基苯棕榈酸酯的水解作为探针反应，对该微反应器内固定化酶催化水解反应动力学进行了研究和计算，并与普通反应器内同样的反应进行比较．通过对比米氏方程参数，证实在微反应器内酶催化水解反应效率比普通反应器内提高3333倍以上，并可提高酶和反应底物的亲和力．作者：王周俊（复旦大学化学系，上海市分子催化和功能材料重点实验室）论文来源：高等学校化学学报2011201120112011年3333月什么是固定化酶所谓固定化，是指在一定空间呈闭锁状态存在的酶，能连续的进行反应，反应后的酶可以回收重复利用。固定化酶是20202020世纪50505050年代开始发展起来的一种新技术，人们通过有目的地将酶包裹于聚合物基质或链接于载体分子而限制酶的移动，也可采用酶的交联，通过蛋白质交联或无活性材料的加入，从而产生了无数用不同材料的固定方法，连接于合成材料载体显示出更多的优越性；最近的交联酶晶体报道给人们提供了一种新的选择。固定化酶的优点具有专择性用途的催化剂可以““““缝制””””2酶的稳定性得到改进1酶可以再生利用3连续化操作得以实现4固定化酶的优点反应的最优化控制成为可能6反应所需空间小5可得到高纯度高产量的产品7资源方便减少污染8只能用于可溶性底物，对大分子底物不适宜3增加了生产成本，工厂的初始投资增大2与完整菌体相比不适宜多酶催化，特别是需要辅助因子的反应4固定化时酶活力有损失1胞内酶必需通过酶的分离手续5固定化酶的缺点固定化酶模式酶的固定化————————物理吸附法这是酶被吸附于不溶性载体的一种固定化方法。此类载体很多，无机载体有活性炭、多孔玻璃、高岭石、金属氧化物等；近年的大孔型合成树脂，陶瓷等载体也十分引人注目;;;;此外还有具有疏水基的载体也可以疏水性吸附酶，等。物理吸附法具有活性中心不被破坏和酶高级结构变化少的优点，若能找到适当的载体这是很好的方法。但是它有酶与载体相互作用弱，酶易脱落等缺点。在王周俊的论文中所用的载体为纳米沸石纳米沸石纳米沸石是指三维尺度均在纳米级（1nm~100nm1nm~100nm1nm~100nm1nm~100nm）的具有一定空间结构的硅铝酸盐晶体，由于晶粒极小，纳米沸石的比表面积尤其是外表面积明显增加，表面原子数与体积原子数之比急剧增加，孔道缩短，外露孔口增多，从而使纳米沸石具有更高的反应活性和表面能，表现出明显的体积效应和表面效应。其外表面积大、吸附能力强和生物相容性良好等优点，是一种适宜的固定酶的多孔材料。同时，纳米沸石粒子具有良好的胶体分散性，表面电荷及硅羟基丰富，是纳米工程组装的理想构件基元．微反应器微反应器通常指通过微加工和精密加工技术制造的小型反应系统．微反应器内流体的微通道尺寸在10101010μμμμmmmm～10mm10mm10mm10mm之间，具有所需空间小、质量能量消耗少、传质速度快以及响应时问短等优点。将微反应器和纳米沸石的优点相结合，利用层层组装法将纳米沸石组装在毛细管内，并固定酶，制备成固定化酶微反应器，有望得到反应效率高于普通反应容器的反应装置。实验中基本反应（底物）4444----硝基苯棕榈酸酯（4444----NPPNPPNPPNPP）（酶）假丝酵母脂肪酶（CRLCRLCRLCRL）（产物）4-4-4-4-硝基苯酚(4-NP(4-NP(4-NP(4-NP）论文主体：1.1.1.1.纳米沸石的筛选2.2.2.2.纳米沸石修饰的微通道反应器构建和稳定性表征3.3.3.3.纳米沸石修饰的微通道反应器内固定化酶催化反应动力学分析纳米沸石的筛选1.1.1.1.实验方法筛选指标（一）：脂肪酶的单位饱和吸附量大5μL10mg/mL纳米沸石溶液10μL5mg/mLCRL溶液485μL缓冲溶液(pH=7）静置吸附约0.50.50.50.5hhhh后，以12000r12000r12000r12000r////minminminmin的转速离心0.50.50.50.5hhhh，取上清用分光光度计测定220nm220nm220nm220nm波长下紫外吸收，计算出上清液中剩余的CRLCRLCRLCRL浓度，通过差减法得出固定在纳米沸石上的CRLCRLCRLCRL量纳米沸石的筛选筛选指标（二）：固定在纳米沸石上的单位质量的脂肪酶活性高等体积的10mg/mL纳米沸石溶液等体积的1mg/mLCRL溶液静置吸附约0000．5h5h5h5h后，配制成0.0.0.0.5mg5mg5mg5mg////mLmLmLmL的纳米沸石固定化CRLCRLCRLCRL溶液70707070μL10101010mmoLmmoLmmoLmmoL////LLLL的4444----NPPNPPNPPNPP异丙醇溶液、910910910910μL异丙醇和20202020μL0.5mg/mg/mg/mg/mLmLmLmL固定化CRLCRLCRLCRL溶液充分混合进行原位动力学检测。检测波长为315nm315nm315nm315nm动力学检测时间2222minminminmin纳米沸石的筛选实验结果进行脂肪酶吸附实验所合成的各种类型纳米沸石的扫描电镜照片用于实验的各种沸石颗粒形态、大小均不一样用于吸附固定CRICRICRICRI的纳米沸石尺寸在100100100100～140nm140nm140nm140nm之间较为均一纳米沸石的筛选实验结果如图为不同类型的纳米沸石在pH=7pH=7pH=7pH=7时对CRLCRLCRLCRL的单位饱和吸附量．可以看出，在pH=7pH=7pH=7pH=7的缓冲溶液中，纳米HHHH----BEABEABEABEA沸石对CRLCRLCRLCRL的单位饱和吸附量最大，纳米BEABEABEABEA沸石和纳米LTLLTLLTLLTL沸石次之．纳米沸石的筛选实验结果CRLCRLCRLCRL在纳米H-BEAH-BEAH-BEAH-BEA沸石上的单位固定量最大，单位质量催化活性也最高，因此选择纳米HHHH----BEABEABEABEA沸石作为固定化酶载体用于构建纳米沸石修饰的微通道反应器．实验方法纳米沸石修饰的微通道反应器的构建和稳定性测试用层层组装法在毛细管内组装一定层数的纳米沸石．将组装完成后的毛细管中充满2222mg/mg/mg/mg/mLmLmLmLCRLCRLCRLCRL溶液使CRLCRLCRLCRL在纳米沸石上饱和吸附将异丙醇以0.50.50.50.5mLmLmLmL////hhhh的速度流过组装好的微通道反应器每经过1h1h1h1h截取一小段熔融石英毛细管，通过扫描电镜观察组装在其内壁上的沸石的剥落情况实验结果纳米沸石修饰的微通道反应器的构建和稳定性测试在0.50.50.50.5mLmLmLmL////hhhh这一相对较高的流速下，组装在熔融石英毛细管内壁的纳米HHHH----BEABEABEABEA沸石并未出现明显的剥落或大块的剥离，扫描电镜获得的照片显示，组装上去的沸石依然致密，总体表现出了良好的稳定性，可以很好地用于纳米沸石修饰的微通道反应器内酶催化水解反应的动力学分析．纳米沸石修饰的微通道反应器内固定化酶催化反应动力学分析————实验方法用纳米沸石固定化CRLCRLCRLCRL溶液或自由CRLCRLCRLCRL溶液进行参照试验0.0.0.0.5555～0.0.0.0.9999mmolmmolmmolmmol////LLLL的4444----NPPNPPNPPNPP异丙醇溶液在注射泵作用下以0.0.0.0.5mL5mL5mL5mL////hhhh流速通过微通道反应器在反应器末端收集流出液利用比色法测定产物含量计算出平均反应速率vvvv，双倒数法作图得到KKKKmmmm值跟VVVVmaxmaxmaxmax值将毛细管近似看作一个圆柱体，其内径为r，毛细管长度为L，注射泵流速以体积流速Wv表示，纳米沸石修饰的微通道反应器内固定化酶催化反应动力学分析————实验结果米氏方程纳米沸石修饰的微通道反应器内固定化酶催化反应动力学分析————实验结果KmKmKmKm值变化不明显VmaxVmaxVmaxVmax提高3~53~53~53~5倍通常VVVVmaxmaxmaxmax和反应活度VVVV越大，表明酶催化效率越高，KKKKmmmm越小则表明酶和底物亲和能力越强微通道反应器所特有的空问限域效应大大提高了催化反应中底物和催化剂的接触几率，缩短了反应扩散距离微通道反应器内修饰的纳米沸石层数不同，则纳米沸石量不同，固定的CRLCRLCRLCRL量也就不同．纳米沸石层数越多，可固定的脂肪酶的量就越大，相应的催化反应速度也越快纳米沸石修饰的微通道反应器内固定化酶催化反应动力学分析————实验结果微通道反应器中催化速率大大提高的原因实验结果显示纳米沸石组装层数并不会影响酶和底物的亲和能力，因此尽管反应速度差别很大，但组装3333，5555和7777层纳米沸石后固定的脂肪酶进行催化反应时与底物的亲和能力(K(K(K(Kmmmm))))只有微小差别．论文总结将纳米沸石的良好生物相容性、高酶固定能力和易组装性能在微反应器内结合起来，构建纳米沸石修饰的固定酶微反应器，并应用于酶催化反应将有望大大提高催化反应速度，从而进一步提高反应选择性，降低反应能耗．另外，由于微通道反应器节段式以及流动性的反应特点，非常有利于多催化反应过程的耦合，是目前绿色化学化工研究和发展的方向．Thankyou!Thankyou!Thankyou!Thankyou!