青蒿素生物合成的研究状况

青蒿素生物合成的研究状况青蒿素是我国科研人员从传统中医药黄花蒿中提取出来并自主研发的一种抗疟疾特效药[1]。20世纪70年代，我国科技工作者从黄花蒿中分离提纯出一种抗疟活性单体——青蒿素，以后又确定了它的分子结构和构型。1986年我国自主研发的蒿甲醚油针剂、青蒿琥酯钠盐的水针剂以及青蒿素栓剂等抗疟疾药作为一类新药在我国批准生产。1995年蒿甲醚率先被收入国际药典，这是我国首次得到国际认可的自主研发新药。目前，青蒿素系列抗疟药已有5种新药(青蒿素、青蒿琥酯、蒿甲醚、双氢青蒿素、复方蒿甲醚)共9种剂型上市并在世界各国销售，每年挽救了数百万重症疟疾患者的生命。除了独特的抗疟作用外，青蒿素系列药物还具有抗血吸虫、肺吸虫、红斑狼疮、皮炎以及免疫调节，抗流感等多种疗效[2]。但是，目前国际抗疟药市场上青蒿素类药物只占有很少的份额，其原因主要在于青蒿素原料缺乏。1植物提取现在，药用青蒿素基本来自植物黄花蒿的提取物。多年来，野生黄花蒿资源分布零散，其中青蒿素含量非常低，仅为0．4％～1．0％，且产量和品质也不稳定，影响生产工艺和成本[3]。人们在其近缘植物中至今尚未发现含有青蒿素的植物。在已探明有利用价值的野生黄花蒿资源中，每年仅可提取青蒿素为10至20吨，远远不能满足市场每年近200吨的需求。另外，由于作为原料的黄花蒿要求在花前收获，这将导致野生黄花蒿种子逐年减少，进而引发资源枯竭。况且从黄花蒿叶和花蕾等部分中提取，但环节较多，费时又费力。2化学全合成青蒿素是具有过氧基团的新型倍半萜内酯，其分子式为C15H22O5，相对分子质量为282.33[4]。青蒿素虽已能人工合成，但由于合成难度大、成本高、毒性较大，未能投入工业化生产[5]。3生物合成鉴于此，青蒿素生物合成的研究，对于有效提高青蒿素的生物产量、青蒿素生物工程应用和黄花蒿药用植物资源的可持续利用，均有较重要大的理论意义和应用价值。3.1青蒿素前体化合物与青蒿素生物合成有关的中间体有十几种，其中最重要的是青蒿酸、青蒿素B、青蒿烯、二氢青蒿素等[6]。3.1.1青蒿酸青蒿酸[7]在黄花蒿中含量高，具有适宜的化学构象，是合成青蒿素及其衍生物的手性合成单体及前体。1983年许杏祥等最先研究了从青蒿酸前体到青蒿素的半合成，并于l986年报道了以R-(+)-2香草醛为原料。经14步合成青蒿素的合成途径。1983年SchmidG等应用烯醇醚5在低温下光氧化反应中引进过氧基，完成了青蒿素的全合成。l988年，汪猷等以青蒿酸为前体，用黄花蒿匀浆体系进行了青蒿素及青蒿素B的生物合成，实验过程中在匀浆中加入放射标记的青蒿酸，结果在青蒿素和青蒿素B中检测到放射性标记，故认为在由(2-14C)一3,5-二羟基-3-甲基戊酸-δ一内酯[(2-14C)-MVA]合成青蒿素和青蒿素B的过程中，青蒿酸是一种重要的中间产物。有研究报道，利用标记的青蒿酸和甲羟戊酸(Mevalonate,MVA)进行了青蒿素体内和体外的生物合成研究，得到了相似结论。JungM等的研究表明，青蒿酸在青蒿中的含量几乎为青蒿素的1O倍，而且显示出同样的抗疟活性，由此进一步证实了青蒿酸是青蒿素合成过程的一种重要中间体。1990年黄敬坚[8]等应用幼苗水插法和顶株扦插法，在黄花蒿体内以(2-14C)-MVA为前体，成功地合成了青蒿酸。1991年夏志强[9]等报道青蒿酸甲酯经溴化产生溴化物，再经氘解生成(15-2H)-青蒿酸甲酯，再经水解生成(15-2H)-青蒿酸。之后他们又用同样方法合成了(15-3H)-青蒿酸。1994年WeatherPJ等在青蒿毛状根中检测到青蒿酸、青蒿素B以及青蒿烯，故而认为青蒿酸、青蒿素B和青蒿烯为青蒿素合成过程的中间体。2003年AbdinMz等亦证明了青蒿酸是青蒿素合成的中间体。3.1.2青蒿素B[10]1987年Akihi1aA等报道了(3H,14C-22)标记3RS—MVA到青蒿素和青蒿素B的转化。VergauweA等认为利用基因工程手段得到的黄花蒿转基因植株．可通过刺激合成途径中某个关键酶的过量表达和抑制消耗青蒿素合成前体的其他代谢途径中的关键酶来达到青蒿素稳定高产的目的。l996年BrownGD从青蒿的地上生长部分中分离出了新颖的开环杜松烷和二羟基杜松交酯，用1H和13CC-NMR光谱学鉴定了其结构，并提出了由青蒿素B和青蒿酸通过二羟基杜松交酯和4,5开环杜松烷的醇烯互变体生物合成青蒿素的机理。青蒿素和青蒿素B均来源于青蒿酸，这与JungM和汪猷等得到的结论一致。3.1.3青蒿烯1994年weatherPJ等在发根农杆菌ATCC15834诱导的黄花蒿发根培养产物中检测到了青蒿烯。同年BrownGD在研究由青蒿酸转化为青蒿素的过程中．从青蒿中获得杜松烯，并推测经杜松烯合成脱氢青蒿素并最终合成青蒿素的生物合成途径。3.1.4二氢青蒿素近年来，出现了以二氢青蒿素为前体原料的两种设计合成路线的方法，一种是将二氢青蒿素与三氟乙酸酐反应制得三氟乙酰基二氢青蒿素，不经分离直接与酚类反应；另一种是将二氢青蒿素与乙酸酐反应制得乙酰基二氢青蒿素后再与酚类反应。3.1.5其他前体其他前体包括二氢青蒿酸、倍半萜类二氢-表-脱氧青蒿素B、青蒿乙素、异戊二烯等。萜类化合物的生物合成是由异戊二烯逐步代谢而实现的，而甲羟戊酸为异戊二烯的生物合成前体。以甲羟戊酸内酯31或异戊烯基焦磷酸32为原料可合成青蒿素。在青蒿叶匀浆中青蒿酸也能转化为青蒿乙素30，青蒿乙素30和11,13-二氢青蒿酸3O是青蒿素生物合成的中间体。Kudakasseril等在青蒿芽的培养过程中，添加以14C标记的异戊烯基焦磷酸，最终在培养物中检测到含有放射标记的青蒿素。2001年Brown等发现，[15一13C2H3]-双氢青蒿酸和双氢-表-去氧青蒿素B等也是青蒿素的前体。2003年，Abdin等发现11,13-二氢青蒿酸26能转化为青蒿素。2003年Martin等研究了紫穗二烯合酶在大肠杆菌中的表达。用紫穗二烯合酶催化法呢基焦磷酸环化可制得青蒿酸生物合成的前体紫穗二烯35。3.2青蒿素生物合成的场所研究Ferreira等通过研究青蒿叶形态，在头状花序中发现了与青蒿素合成有关的透明的T腺状细胞列，确定这就是青蒿素及其相关化合物合成及汇集的场所，并不是所有的细胞都具有合成青蒿素的能力。它提示应将提高青蒿素生物合成的重点转移到增加T腺状细胞上，应通过各种方法尽可能增加T腺状细胞的数量，从而提高青蒿素生物合成的能力。3.3青蒿素生物合成途径[11]青蒿素生物合成前体和中间体的深入研究为青蒿素生物合成路线提供了丰富的材料，此外，同位素技术、质谱和核磁共振等技术的发展为其代谢途径提供了十分有利的手段。青蒿素生物合成途径属于植物类异戊二烯代谢途径．可分为三大步：由乙酸形成FPP，合成倍半萜，再内酯化形成青蒿素。Wallwaart等将生物合成途径概括为：FPP→4，11→二烯倍半萜→青蒿酸→二氢青蒿酸→二氧青蒿酸过氧化物→青蒿素。植物类异戊烯生物合成存在甲羟戊酸和丙酮酸P磷酸甘油醛两条途径。青蒿素等倍半萜类的生物合成途径在细胞质中进行，属于甲羟戊酸途径。l987年，Akhila等通过放射性同位素永踪法发现青蒿素的生物合成途径为：FPP→青蒿酸→二氢青蒿酸→青蒿素。生物合成青蒿素的途径近年来引起了广泛关注，但目前的工作仅涉及合成青蒿素的生物合成中间体，而青蒿素最终产品的研究进展不大，且鲜见报道。但这恰恰是可能提高青蒿素市场供给的最重要途径，因此要全面加大青蒿素最终产品生物合成的研究力度。3.4青蒿素生物合成关键酶及其基因的调控人们在对青蒿素合成路线研究的过程中，认为有几个关键酶的作用十分明显。其中以法尼基焦磷酸合成酶、倍半萜环化酶以及内脂形成过程的加氧酶或氧化酶对青蒿素的作用最为重要[12]。我国有科技人员[13]经深人研究提出了三点观点：一是青蒿素生物合成的分子代谢调控，可通过添加生化合成前体，或控制关键酶，或激活关键酶控制的基因，或关键酶基因转化等方法，大幅度提高青蒿素含量。二是关键酶基因的克隆，并在合适的青蒿离体培养体系和微生物中高效表达。三是利用基因工程手段改变关键酶基因，可大大增强控制酶的效率[14]。综上所述．青蒿素的生物合成研究是增加青蒿素供给的重点方向之一。青蒿素及其衍生物的生物合成受到多种限速酶所调控，且一些编码限速酶基因的表达可能具有高度的组织和时空特异性。因此，通过导入过量表达的限速酶基因或抑制其它分支途径的反义基因，可提高转基因器官或植株中青蒿素及其衍生物的含量。同时，在相关的微生物(内生细菌、真菌)中导入青蒿素合成酶基因，可望为应用转基因微生物发酵工业化生产青蒿素奠定基础。在青蒿素代谢研究方面，青蒿素生物合成关键步骤及相应酶类的确定是值得首先重视的领域。参与青蒿素合成的酶类数量多、催化反应的种类也多，这就使得生物合成调节的研究存在许多困难。但是由于分子生物学的进展，获得某些关键酶的cDNA克隆产物已成为可能，相关的分子生物技术为生物合成调节细节的研究提供了重要的工具，基因工程手段将成为青蒿素合成代谢调控的新途径。参考文献[1]陈思安,韩颂,赵敏.产青蒿素作物黄花蒿的研究现状及展望[J].黑龙江医药,2010,6(23):891-894.[2]王建平.青蒿素的应用及其作用机制.医药化工[J],2008,11:11-14.[3]吴代娟,罗桂甫.青蒿素生物合成研究进展综述.精细化工中间体[J],2008,6(38):12-16.[4]青蒿素结构研究协作组．一种新型的倍半萜内脂-青篙素[J].科学通报,1977(3)：142.[5]静一，罗安才.青蒿素生物合成研究进展[J]．安徽农业科学,2010,38(4):1698-1701.[6]青蒿素生物合成研究成热点.中国制药信息,2009,25(8):11-12.[7]卢文婕.青蒿素生物合成的研究进展.山西中医学院学报,2009,10(2):6-7.[8]黄敬坚,周凤仪,吴莲芬,等．青蒿素生物合成研究I[J]．化学学报.l990．48：275—277．[9]夏志强,黄敬坚,汪猷,等．青蒿素生物合成研究Ⅱ[J]．化学学报．1991,49：1514—1518．[10]石开云,梅林,蔡中文.青蒿素前体研究进展.药学专论,2007,16(10):25-26.[11]梅林,石开云.青蒿素生物合成研究进展.药学专论,2007,15(19):27-28.[12]李弘剑,张毅,郭勇，等.体外胁迫促进青篙素在黄花蒿培养细胞中合成的研究[J].药物生物技术.2001,8(1):12—16．[13]杨水平,杨宪,黄建国,等.青蒿素生产研究进展[J].热带亚热带植物学报.2004,12(2):189—194．[14]王红,叶和春,刘本叶,等.青蒿素生物合成分子调控研究进展[J].生物工程学报,2003.19(6):646—650.[15]王剑文,邹婷,张犇,等.青蒿素生物合成的研究进展.抗感染药学,2009,6(2):79-82.