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项目五任务二食品微生物育种基本程序及操作一、菌种的来源根据资料直接向有科研单位、高等院校、工厂或菌种保藏部门索取或购买；从大自然中分离筛选新的微生物菌种。二、分离思路新菌种的分离是要从混杂的各类微生物中依照生产的要求、菌种的特性，采用各种筛选方法，快速、准确地把所需要的菌种挑选出来。实验室或生产用菌种若不慎污染了杂菌，也必须重新进行分离纯化。有了优良的菌种，还要有合适的工艺条件和合理先进的设备与之配合。定方案：首先要查阅资料，了解所需菌种的生长培养特性。采样：有针对性地采集样品。增殖：人为地通过控制养分或培条件，使所需菌种增殖培养后，在数量上占优势。分离筛选：采用选择性培养基利用分离技术得到纯种目的菌。发酵性能测定：进行生产性能测定。这些特性包括形态、培养特征、营养要求、生理生化特性、发酵周期、产品品种和产量、耐受最高温度、生长和发酵最适温度、最适pH值、提取工艺等。三、新种分离与筛选的步骤（一）采样1、采样对象以采集土壤为主。一般园田土和耕作过的沼泽土中，以细菌和放线菌为主，富含碳水化合物的土壤和沼泽地中，酵母和霉菌较多，如一些野果生长区和果园内。采样的对象也可以是植物，腐败物品，某些水域等。从自然界筛选2、采样季节：以温度适中，雨量不多的秋初为好。3、采土方式：在选好适当地点后，用小萨子除去表土，取离地面5-15cm处的土约10g，盛入清洁的牛皮纸袋或塑料袋中，扎好，标记，记录采样时间、地点、环境条件等，以备查考。为了使土样中微生物的数量和类型尽少变化，宜将样品逐步分批寄回，以便及时分离。采取土壤样品要考虑的几个问题土质肥，微生物含量高，特别肥沃的土壤中细菌多，放线菌少；在植物残体枯枝落叶下的土壤中较多含有拮抗性真菌。离地面5~20cm处的土壤通气良好、不受阳光直射，含菌量最高。采土季节以春秋两季最好。采土方法：选择适当地点、铲除表土、取土样数十克，盛入事先准备的无菌防水纸袋中，其上记录采土时间、地点、植被情况等。多点采土、混合分离，可以代表每一地块上的微生物分布平均情况（二）增殖培养含有目的菌较多的土样不需要富集培养如果原有样品中目的菌含量低，可以人为地添加相应的基质，培养使之以较其它微生物更快的速度生长繁殖，从而提高它们在样品中的比例，便于分离。富集培养的一般方法：采用有利于目的菌种而不利于无关微生物的营养和培养条件，以达到使目的菌种在群体中比例上升的目的。例如碳源利用的控制，可选定糖，淀粉、纤维素，或者石油等，以其中的一种为唯一碳源，那么只有利用这一碳源的微生物才能大量正常生长，而其它微生物就可能死亡或淘汰。这样对下阶段的纯种分离就会顺利得多。一些有特定物质产生能力的菌种，不容易富集，只有通过大量艰苦的工作筛选取得。某些细菌的富集条件富集对象接种菌样添加营养物(g)特殊培养条件好氧氨基酸氧化菌土壤–好氧，pH7.0好氧性芽孢杆菌土壤，巴氏消毒–好氧，pH7.0氨基酸发酵性梭菌土壤，巴氏消毒–厌氧，pH7.0耐碱解尿素芽孢菌土壤，巴氏消毒尿素50好氧，pH8.6厌氧八叠球菌土壤葡萄糖20厌氧，pH2~3乳酸菌植物体或牛奶葡萄糖20厌氧，pH6.5肠道细菌土壤或污水葡萄糖20，CaCO320好氧或厌氧，pH7.0丙酸菌干酪乳酸钠20厌氧，pH7.0醋酸菌果实或生啤酒乙醇40好氧，pH6.0注：培养基成分为酵母膏10g，KH2PO4或K2HPO41.0g，MgSO4·7H2O0.2g，加水1000ml。一般培养在30℃下。（三）培养分离纯化尽管通过增殖培养效果显著，但还是处于微生物的混杂生长状态。因此还必须分离，纯化。在这—步，增殖培养的选择性控制条件还应进一步应用，而且控制得细一点，好一点。纯种分离的方法有划线分离法、稀释分离法。稀释分离法•稀释倒平板法•平板涂布法注意：必须要做多个浓度的稀释分离平板。•划线分离法——平板划线法（四）筛选1、初筛：从分离得到的大量微生物中，将目标微生物筛选出来的过程。常用的初选方法：•水解酶产生菌的筛选：将酶的作用底物加在培养基中，接种后适温培养，根据菌苔周围是否产生水解圈筛选出水解酶产生菌。一般采用平板筛选。•拮抗菌的筛选—对峙培养：将病原指示菌与待测菌株相对接种在平板上适温培养，根据病原菌的生长情况筛选出拮抗性菌株。分初筛、复筛。2）摇瓶发酵筛选：将待测菌株进行液体振荡培养，取发酵滤液进行活力测定。2、复筛：在初筛的基础上，进一步鉴定有希望菌株的生产能力强弱的过程。•复筛采用摇瓶培养后，发酵液采用精确的分析方法进行测定。•复筛过程中，要结合培养条件进行。培养条件包括：培养基pH值发酵温度供氧量等。（五）菌种鉴定经典分类鉴定方法：形态特征、生理生化特征、血清学试验等。现代分类鉴定方法：遗传特性、细胞化学组分、计算机数值分析。（六）毒性试验自然界的一些微生物是在一定条件下产毒的，将其作为生产菌种应当十分当心，尤其与食品工业有关的菌种，更应慎重。据有的国家规定，微生物中除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草杆菌作为食用无须作毒性试验外，其他微生物作为食用，均需通过两年以上的毒性试验。任务三食品微生物育种技术一、诱变育种中的几个原则指利用物理或化学诱变剂处理微生物群体细胞，促进其突变率显著提高，然后设法从中选取少数符合育种目的的突变株。2个主要环节：诱变（随机）选用合适的诱变剂和诱变剂量处理大量均匀、分散的微生物细胞，以引起绝大多数细胞致死的同时，使存活个体中的突变频率大大提高。筛选（定向）设计有效的筛选方法，将少量正变株中的优良菌株挑选出来。（一）出发菌株（originalstrain）出发菌株指用于诱变育种的起始菌株。•具有有利性状（如高产、生长速度快、营养要求粗放、标记明显等）；•对诱变剂敏感•野生型菌株；•从生产中选育的自发突变菌株；•诱变获得的高产菌株出发菌株的选择标准：出发菌株的来源：二、诱变育种的方法（二）菌悬液的制备1.选用单细胞或单孢子悬液（均匀、分散）目的：①使每个细胞能均匀接触诱变剂；②减少表型延迟现象（诱变后性状的分离及退化现象）2.同步培养（生理状态一致）3.菌龄：对诱变剂最敏感时期营养细胞：对数期孢子或芽孢：萌发前期4.菌悬液的制备方法物理诱变：生理盐水配制化学诱变：缓冲液配制5.菌悬液的浓度酵母菌，霉菌的孢子：106个/mL细菌，放线菌孢子：108个/mL（三）诱变剂的选择及处理方法1.诱变剂的选择（高效，简便）物理诱变剂：频度低、大损伤，难修复，且操作简便；化学诱变剂：频度高，点突变，易回复突变，操作麻烦。(NTG——超诱变剂）UV是最常用的一种诱变剂2.剂量的选择突变率随剂量的增加而提高，但到达一定程度后，再提高剂量,反而会使突变率下降。正变较多出现在偏低剂量中，而负变较多出现在偏高剂量中。在产量变异工作中，常采用相对杀菌率为70~75%,甚至30~70%的剂量。UV的剂量:固定UV功率和照射距离,以照射时间长短来确定剂量多少。最适剂量：在提高突变率的基础上，既能扩大变异幅度，又能使变异向正突变范围移动的剂量。常以杀菌率来表示相对剂量（剂量-存活率曲线）3.诱变处理方法单因素处理或多因素的复合处理：①同一诱变剂的重复使用；②两种或多种诱变剂的先后使用；③两种或多种诱变剂的同时使用.（四）中间培养（CM，培养过夜）目的：克服表型延迟表型延迟（phenotypiclag）：表型的改变落后于基因型改变的现象.分离性延迟：突变的基因经DNA复制和细胞分裂后变成纯合状态，表型才能表现出来。生理性延迟：由杂合状态变为纯合状态，突变表型仍不能表现出来。分离性延迟的原因:对数生长期中，单核细胞常出现双核现象，多核细胞的核也成倍增加，诱变对数期的细胞时，突变通常发生在一个核上，故其变异或非变异的细胞必须经过一代或几代繁殖才能分离，这种纯种变异细胞出现的推迟现象称为分离延迟现象。生理性延迟的原因:当变异细胞由杂合状态变为纯合状态时,由于杂合期所合成的非变异的蛋白或酶仍然发挥作用,必须经过细胞多代分离后,才能将这些非变异的酶稀释掉,最终达到变异后应该表现的形态,如营养缺陷型突变株的筛选过程。（五）突变株的筛选初筛复筛1.初筛（以量为主）（1）利用形态变异：需预先测定形态与产量的相关性（2）根据平板颜色反应直接挑选透明圈法（蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶）；抑菌圈法（抗生素）；变色圈法（柠檬酸）、显色圈（氨基酸）；沉淀圈法（外毒素）透明圈直径（H）/菌落直径（C）：产量高低（初筛指标）2.复筛（以质为主，定量测定）摇瓶培养，直接检测所需产物方法需简便、快速2步诱变育种的基本原则：•选择简便有效的诱变剂；•挑选优良的出发菌株；•处理单细胞或单孢子悬液；•选用最适的诱变剂量；•充分利用复合处理的协同效应；•利用和创造形态、生理与产量间的相关指标；•设计高效筛选方案；•创造新型筛选方法。三.营养缺陷型突变株的筛选（1）几个概念：三类培养基：基本培养基（MM,minimalmedium）[-]：某野生型能生长的最低成分的组合培养基。完全培养基（CM,completemedium）[+]：各种营养缺陷型能生长的天然或半组合培养基补充培养基（SM,supplementalmedium）[A]:[-]+A[B]:[-]+B相应营养缺陷型能生长的组合或半组合培养基三种遗传型：野生型（wildtype）从自然界分离到的、发生营养缺陷型突变前的原始菌株。[A+B+],可在[-]生长。营养缺陷型（auxotroph）野生型菌株经诱变剂处理后，由于发生了丧失某种酶合成能力的突变，因而只能在加有该酶合成产物的培养基中才能生长的突变菌株（主要指合成维生素、氨基酸及嘌呤、嘧啶的能力）。[A+B-]：能在[+]、[B]生长[A-B+]：能在[+]、[A]生长[A-B-]：能在[+]生长原养型（prototroph）营养缺陷型经回复突变或重组，回到原来野生型的营养要求[A+B+],可在[-]生长（2）筛选步骤（5步）诱变处理中间培养淘汰野生型检出缺陷型鉴定缺陷型①中间培养CM或SM培养基，培养过夜。克服表型延迟。②淘汰野生型即浓缩缺陷型，以提高检出率方法抗生素法（G+细菌：青霉素；酵母菌和霉菌：制霉菌素）菌丝过滤法（丝状真菌、放线菌）饥饿培养（无N）MM6~12h2N培养(2N)MM1~2h加抗生素(或菌丝过滤)，培养过夜③营养缺陷型的检出方法夹层培养法限量补充培养法逐个检出法影印平板法④营养缺陷型的鉴定生长谱法：快速，直观分两步：a.三大类营养要求（氨基酸、维生素、核苷酸）的鉴定b.具体到某一种营养要求的鉴定(哪一种氨基酸,哪一种维生素,或哪一种碱基)具体操作:一般采用“滤纸片法”a.不含维生素的酪素水解液或氨基酸混合液b.维生素混合液c.0.1%碱水解酵母核酸液abc三大类营养要求的鉴定：以氨基酸缺陷为例进行说明将18种氨基酸按右表分为6组特点：每2组只有一种共同物质单一营养物质要求的鉴定：组别化合物代号117891011227121314153381216171844913161920551014171921661115182021135246（3）营养缺陷型的用途生产菌(氨基酸、核苷酸、维生素等高产菌需求)；研究代谢途径和杂交、转化等遗传规律的遗传标记。诱变育种的程序：出发菌株（纯化）前培养（CM，培养至对数期）菌悬液制备活菌计数诱变预备实验（剂量存活率曲线）诱变处理（相对杀菌率为70-75%，30-70%）活菌计数中间培养（CM，培养过夜，克服表型延迟）突变株分离初筛复筛生产性能试验菌种（鉴定与）保藏二、杂交育种发酵工业的优良菌种的选育主要采用诱变育种方法。但是，一个菌种长期使用诱变剂处理之后，其生活能力一般要逐渐下降，例如生长周期延长，孢子量减少，代谢减慢，产量增加缓慢，诱变因素对产量基因影响的有效性降低等。因此，有必要利用杂交育种方法。杂交育种是指将两个基因型不同的菌株经吻合（或接合）使遗传物质重新组合，从中分离和筛选具有新性状的菌株。1、杂交育种的目的在于：1）通过杂交使不同菌株的遗传物质进行交换和重新组合，从而改变原有菌株的遗