食品微生物学实验技术

96食品微生物学实验技术实验1食品中细菌菌落总数的测定1目的要求（1）掌握食品中菌落总数测定方法。（2）了解食品清洁程度（被污染程度）及观察细菌在食品中繁殖的动态，从而为被检样品进行卫生学评价时提供依据。2基本原理菌落（colony）是指细菌在某一种固体培养基上克隆增殖发育成肉眼可见的细菌集团。菌落总数是指食品检样经过处理，在一定条件下培养后（如培养成分，培养温度和时间、pH、需氧性质等），所得1mL（g，cm2)检样中所含菌落总数。通常以cfu/g（mL，cm2)表示，cfu代表的colonyforningunit。菌落总数是作为判定食品的清洁程度（被污染程度）的标记，通常越干净的食品，单位样品菌落总数越低。反之，菌落总数就越高。菌落总数的测定是以每个活细菌能克隆增殖形成一个可见的单独菌落为基础的，但是在实践中除了单个细胞形成菌落外，二个或两个以上相连的同种细胞也同样可形成菌落，所以现在均以菌落总数（而不是活细菌数）或菌落形成单位数表达。由于菌落总数的测定是在37℃有氧条件下培养的结果，对于厌氧菌、微需氧菌、嗜冷菌和嗜热菌在此条件下不生长，有特殊营养要求的细菌也受到限制。因此，这种方法所得到的结果，实际上只包括一群在普通营养琼脂中发育、嗜中温的需氧和兼性厌氧的细菌菌落的总数。但由于在自然界这类细菌占大多数，其数量的多少能反映出样品中细菌的总数，正因为如此，用该方法来测定食品中含有的细菌总数已得到了广泛的认可。3实验材料3．1仪器恒温箱、冰箱、恒温水浴锅、天平、微波炉、均质器。3．2材料吸管（容量为0.1mL、1m和10mL）、广口瓶或三角烧瓶、灭菌平皿、试管、酒精灯、试管架、灭菌剪刀、灭菌镊子。3．3试剂营养琼脂培养基、75%乙醇、0.85%生理盐水。4实验方法与步骤4．1菌落总数实验程序（如图28-1）4．2检样稀释及培养（1）以无菌操作将检样25g(25mL)剪碎放于装有225mL灭菌生理盐水和玻璃珠的三角瓶内，经过充分振荡或均质处理制作成1：10的均匀稀释液（固体食品有的需先用灭菌研钵研磨后再稀释）。（2）用1mL灭菌吸管吸取1：10稀释液1mL，沿管壁徐徐注入含有9mL灭菌生理盐水的试管内（注意吸管尖端不要触及管内稀释液），振摇试管混合均匀，作成1：100稀释液，按上述操作顺序，作10倍系列稀释液，每递增稀释一次，即换用1支1mL灭菌吸管。（3）根据食品卫生标准要求或对标本污染情况的估计，选择2～3个适宜稀释液，分别在作10倍递增稀释同时，吸取该稀释度的吸管移取1mL稀释液于灭菌平皿内，每个稀释度作两个平皿。（4）稀释液移入平皿后，应及时将融化并冷却到46℃营养琼脂培养基注入平皿约15mL，并转动平皿使其混合均匀，同时将营养琼脂培养基注入加有无菌生理盐水的灭菌平皿内作空白对照。（5）待琼脂凝固后，翻转平板，置36+1℃温箱内培养24+2hr（肉、乳和蛋品为48+2h，水产为30℃48+2h）。974．3菌落计数将培养24h后的平板取出，选取菌落数在30～300之间的平板作为菌落总数测定标准，一个稀释度使用两个平板，取两个平板的平均数，乘以稀释倍数，即得每克（或毫升）样品所含菌落总数。4．4平板菌落计数方法(1)平板菌落数的选择选取菌落数在30～300个之间的平板作为菌落总数测定的标准，且一个稀释度应使用两个平板的平均数。其中当一个平板有较大片状菌落生长时，若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘2以代表全皿菌落数。(2)稀释度的选择A．应选择平均菌落数在30～300之间的稀释度，乘以稀释倍数报告之。B．若有两个稀释度，其生长的菌落数均在30～300个之间，则视二者之比如何来决定，若其比值小于2，应报告其平均数；若两者之比大于2，则报告其中较小的数字。C．若所有稀释度的平均菌落数均大于300，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。D．若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度最底的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。E．若所有稀释度均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数报告之。F．若所有稀释度的平均菌落数均不在30～300之间，其中一部分大于300或小于30时，则以最接近30或300的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。(3)菌落数的报告菌落数在100以内时，按其实有数报告，大于100时，采用二位有效数字，在二位有效数字后面的数值，以四舍五入方法计算，为了缩短数字后面的零数，也可用10的指数来表示。48+2h36+1℃检样做成几个适当倍数的稀释液选择2～3个适宜稀释度，各以1ml量加入灭菌平皿内每皿内加入适量营养琼脂菌落计数结果图28-1菌落总数实验程序98(见表28-1)表28-1稀释度选择及菌落数报告方式例次稀释液及菌落数两稀释液之比菌落总数（cfu/g，mL）报告方式（cfu/g，mL）10-110-210-31多不可计16420-16400016000或1.6×1042多不可计295461．63775038000或3.8×1043多不可计271602．22710027000或2.7×1044多不可计多不可计313-313000310000或3.1×105527115-270270或2.7×1026000-1×10107多不可计30512-3050031000或3.1×1045实验结果（1）将实验得到的菌落总数结果记入下表10-210-310-410-5备注12平均（2）报告所选两个稀释度之比及检测结果。6注意事项（1）若实验样品为食品，为防止食品碎屑混入琼脂影响计数，通常需在琼脂中添加一定量TTC(氯化三苯四氮唑)，每100mL加1mL0.5%TTC，培养后，如系食品颗粒，不见变化，如为细菌，则生成红色菌落。（2）理论上讲，为了得到实验食品中所有细菌菌落总数，应将样品接种到几种不同的培养基中并培养在不同的条件下，所得到的细菌菌落数总和。但根据国家颁发的不同食品的规定，都是根据用普通营养琼脂，37℃（水产品30℃）进行需氧培养的结果来确定的，而且这种测定确具代表性，因而菌落总数在一般卫生学评价中并不要求用不同培养基进行选择性培养。（3）目前还有几种快速检测菌落总数的方法如由军事医学科学院研制而成食品细菌检验箱，菌落总数测定采用试管斜面计数法操作简便，不易受污染，结果与国标法平板计数一致。另一种是3M有限公司提供的PetrifilmPlates测试片（菌落总数测试片）。由于测试片中含有一种红色指示剂，使所有菌落易于识别计数，该片也可用于乳酸菌测定，48hr可确定菌落总数。7思考题（1）什么是菌落总数，何谓cfu？（2）若平板上菌落数生长一半较均匀，另一半呈片生长，如何计数菌落数？99（3）影响杂菌总数准确性的因素有哪些？实验2食品中大肠菌群的测定1目的要求（1）学习与掌握食品中大肠菌群的测定方法。（2）了解大肠菌群在食品卫生学检验中的意义。2基本原理大肠菌群系指一群在37℃24hr能发酵乳糖产酸产气，需氧或兼性厌氧的埃希氏无芽孢杆菌。它包括大肠埃希氏杆菌和柠檬酸杆菌、阴沟肠杆菌等类大肠杆菌。大肠菌群的检测就是根据大肠菌群的定义，即利用它们能发酵乳糖产酸产气的特性而设计的初发酵实验；初发酵阳性管通过伊红美兰平板进行分离；复发酵对分离菌作证实实验的三步法。根据证实为大肠菌群阳性管数，查MPN检索表，报告每100mL（g）大肠菌群的最可能数（食品中大肠菌群系以每100mL（g）检样内大肠菌群最可能数MPN表示），MPN最可能数是表示样品中活菌密度的估计。3实验材料3．1仪器温箱、冰箱、恒温水浴、天平、微波炉、均质器、普通光学显微镜。3．2材料吸管（0.1mL、1mL和10mL）、广口瓶或三角烧瓶、玻璃珠、平皿、试管、酒精灯、试管架、灭菌剪刀、镊子、小倒管等。3．3培养基乳糖胆盐培养基，伊红美兰琼脂，乳糖发酵培养基，革兰氏染色液，0.85%生理盐水。4实验方法与步骤4．1大肠菌群检验程序（如图29-1）4．2检样稀释取检样25g(mL)剪碎，以225mL灭菌生理盐水稀释做成1:10稀释液，并依次做10倍递增稀释液，例如10-1，10-2，10-3，10-4等，估计样品污染程度，选择3个合适稀释液备用。4．3乳糖发酵试验将待稀释检样品接种乳糖胆盐发酵管内，接种量在1mL以上者，用双料乳糖胆盐发酵管，1mL及1mL以下者，用单料乳糖胆盐发酵管，每一稀释度接种3管，置36+1℃温箱内培养24+2h，如所有乳糖胆盐发酵管都不产气，可报告为大肠菌群阴性。如有产气者，则按下列程序进行。4．4分离培养用接种环挑取产气的乳糖胆盐发酵管划线接种在伊红美兰琼脂平板上，36+1℃温箱内18～24h培养，观察菌落形态，并作革兰氏染色和证实试验。典型的大肠埃希氏菌落呈紫黑色金属光泽，非典型大肠菌群有时为红色菌落。4．5证实试验在上述平板上，挑取带有黑色金属光泽的可疑大肠菌群菌落1～2个进行革兰氏染色，同时接种乳糖发酵管36+1℃培养24+2h后观察产气情况。凡乳糖管产气，革兰氏染色阴性的无芽孢杆菌即可报告为大肠菌群阳性。1005实验结果（1）将大肠菌群检验结果填入下表接种量管号发酵反应结果有无典型菌落革兰氏染色结果复发酵反应结果最后结论+或-1mL1230.1mL1230.01mL123检样稀释乳糖胆盐发酵管(36+1℃,24+2h)不产气大肠菌群阴性报告产气伊红美兰琼脂平板(36+1℃,24+2h)↓(24+2h,36+1℃)革兰氏染色乳糖发酵管(36+1℃,24+2h)革兰氏染色阳性革兰氏阴性无芽胞杆菌产气不产气大肠菌群阴性报告大肠杆菌阳性报告大肠菌群阴性报告图29-1大肠菌群检验程序101（2）根据证实为大肠菌群的阳性管数，查（MPN检索表后报告每100mL(g)大肠菌群的最可能数。6注意事项双料乳糖发酵管除蒸馏水外，其他成分加倍。30mL和10mL乳糖发酵管专供酱油及酱类检验用，3mL乳糖发酵管供大肠菌群证实试验用。（1）初发酵实验与证实实验有时不一定符合。凡初发酵的产气管一定要做伊红美兰平板分离。如果平板出现典型的大肠菌菌落，G-染色阴性无芽孢菌，即可做出判定。如果平板上典型菌落少，应多挑取菌落包括挑菌落中心黑红、灰红，以及红、粉红等菌落，在革兰氏染色的同时，做证实试验，以免出现假阴性。（2）关于产气发酵管内的小倒管如储留气体则是阳性结果，如果不存留气体，但液面及管壁可以看到缓慢上浮的小气泡，或者对没有气体产生的发酵管用手轻轻弹动试管，有气泡出现而且沿管壁上升，都应考虑可能是由菌发酵产生气体的缘故。应做进一步观察，因为这种情况阳性检出率可达50%以上。（3）所谓典型大肠埃希氏菌是指具有该菌所有生物学特性的大肠菌。新近随粪便排出的大肠菌多属于这一类型。所以如查出多量典型大肠埃希氏菌表明样品是粪便的近期污染结果。研究表明，典型大肠菌随粪便排到外界环境中约一周后，典型菌可变为非典型菌。这种变化以生化变异为主。如果样品检测以非典型大肠菌为主，则指示样品受粪便的远期污染。大肠埃希氏菌大量存在于人畜肠道，并随粪便排出。本菌在粪便中数量多，易于培养，对外界的抵抗力与肠道致病菌比较相近，所以选择大肠埃希氏菌作为被粪便污染的指示菌，合理、科学。凡被粪便污染的样品，就有可能受到致病菌污染。所以大肠菌群的测定是必做的食品卫生学检项目。（4）大肠菌群检验方法（国标）采用的管发酵通常需三天，目前已开发出几种快速检验方法（TTC显色法，DC试管法，纸片法）。如由军事医学科学研究院研制而成的一小时快速检测法，检验结果与国标法一致。3M中国有限公司提供的petrifilmplates测试片，可在２４小时确定大肠菌群数。7思考题（1）什么是大肠菌群？大肠菌群表示的单位及其意义。（2）固体检样三个稀释度检测结果都是阴性时，MPN怎样表示？（3）液体检样三个稀释度检测结果都是阴性时，MPN怎样表示？（4）大肠菌群检验中为什么首先要用乳糖胆盐发酵管发酵？实验3食品中金黄色葡萄球菌的检测1目的要求（1）了解食品和食物中毒样品中金黄色葡萄球菌的检测方法。（2）观察金黄色葡萄球菌的革兰氏染色镜检形态以及在血平板和Bai