食品微生物检验

第七章食品微生物检验学习本章的意义和内容：掌握光学显微镜的使用方法，掌握细菌染色标本的制作技术。掌握样品的采集和处理方法。掌握菌落总数的测定方法与步骤。掌握大肠菌群的测定方法与步骤。学会乳糖胆盐发酵管培养基的制备。掌握革兰氏染色方法。本章习题内容主要涉及：食品微生物检验的范围；食品微生物检验的指标；细菌染色的基本方法和步骤；常用染色方法及染色液；食品微生物学一般检验技术。一、食品微生物检验的意义食品微生物检验方法为食品监测必不可少的重要组成部分。(1)它是衡量食品卫生质量的重要指标之一，也是判定被检食品能否食用的科学依据之一。(2)通过食品微生物检验，可以判断食品加工环境及食品卫生环境，能够对食品被细菌污染的程度做出正确的评价，为各项卫生管理工作提供科学依据，提供传染病和人类、动物和食物中毒的防治措施。(3)食品微生物检验是以贯彻“预防为主”的卫生方针，可以有效地防止或者减少食物中毒人畜共患病的发生，保障人民的身体健康；同时，它对提高产品质量，避免经济损失，保证出口等方面具有政治上和经济上的重要意义。二、食品微生物检验的范围食品微生物检验的范围包括以下几点：(1)生产环境的检验：车间用水、空气、地面、墙壁等。(2)原辅料检验：包括食用动物、谷物、添加剂等一切原辅材料。(3)食品加工、储藏、销售诸环节的检验：包括食品从业人员的卫生状况检验、加工工具、运输车辆、包装材料的检验等。(4)食品的检验：重要的是对出厂食品、可疑食品及食物中毒食品的检验。三、食品微生物检验的指标我国卫生部颁布的食品微生物指标有菌落总数、大肠菌群和致病菌三项。(1)菌落总数菌落总数是指食品检样经过处理，在一定条件下培养后所得1g或1mL检样中所含细菌菌落的总数。(2)大肠菌群大肠菌群是寄居于人及温血动物肠道内的肠居菌，它随着的大便排出体外。食品中如果大肠菌群数越多，说明食品受粪便污染的程度越大。(3)致病菌致病菌即能够引起人们发病的细菌。对不同的食品和不同的场合，应该选择一定的参考菌群进行检验。(4)霉菌及其毒素我国还没有制定出霉菌的具体指标，鉴于有很多霉菌能够产生毒素，引起疾病，故应该对产毒霉菌进行检验。(5)其它指标微生物指标还应包括病毒，肝炎病毒、猪瘟病毒、鸡新城疫病毒、马立克氏病毒、口蹄疫病毒，狂犬病病毒，猪水泡病毒等；另外，从食品检验的角度考虑，寄生虫也被很多学者列为微生物检验的指标。四、染色细菌标本检查法微生物中细菌、致病菌是很小的生物体，必须通过染色的方法，在显微镜下才能看得清楚，并且还可以通过染色的方法鉴别革兰氏染色特性，以及是否长有鞭毛、周毛、荚膜和芽孢等。1、染料细菌染色用的染料多为有色泽的有机酸或者有机碱，因为其溶解度有限，一般使用其盐类。可分为以下四类。(一)酸性染料染色离子带阴电，因此，又叫做阴离子染料。它能与带阳电的物质结合，使之着色。降低菌液的pH而使细菌带阳电时，就可用酸性染料染色。如伊红、刚果红等。(二)碱性染料染料离子带正电，也叫做阳离子染料。它能与带负电的物质结合。细菌一般带负电，所以细菌染色所用的染料，常用碱性染料，如美蓝、碱性复红等。一部分碱性染料，如碱性复红、美蓝等具有与氢结合的能力，结合后双键饱和，色基不再存在。此时，化合韧杖还原，成为无色的化合物，再经氧化即可显色。(三)复合染料碱性染料与酸性染料的结合物，叫做复合染料，或叫中性染料。例如wright染料中的伊红美蓝，Giemsa染料中的伊红天青等。(四)单纯染料被染杖柒物生成盐类。它的染色能力，视其能否溶于被染物而言。它们大多数属于偶氮化合物，具有脂溶性而不溶于水，如苏丹类(Sudans)染料。2、影响染色的因素不同细菌其细胞壁酌结构、细胞膜的通透性，膜孔的大小等有一定的羌别，用染料对其染色时．可能会有不同的结果。此外，培养基的组成、菌龄、染色液中电解质含虽和pH、温度、药物等，都可能影响细的染色情况。3、细菌染色的基本方法和步骤3.1基本方法3.1.1单染色法单染色法是用一种染料染色的方法。例如用美蓝或稀释击炭酸复红等，使各种细菌染成间—种颜色。故此法只显小细菌的形态和大小，对细菌鉴别价值较小。在染色过程中常加入媒染剂如碘、石炭酸、明矾或者加热的方法，以增加染料对细菌的亲和力。3.1.2复染色法复染色法是用两种以上染料染色的方法，此法除显示细菌形态大小外，不同类型的细菌可以染上不同的颜色，从而具合鉴别细菌种类的价值，因此也称鉴别染色法。用复染色法染色时，所用的脱色剂如酒精、丙酮或酸类，用于检查染料和细菌结合的牢固程度，最后用与初染色剂颜色有鲜明对比的染料进行复染，以便进行观察，区别细菌种类。常用的复染色法有革兰氏染色法和抗酸染色。3.1.3细菌持殊结构的染色法检查细菌的特殊结构，如鞭毛、英膜、异染颗粒等对鉴别细菌很有帮助。细菌特殊结构染色法不仅能使特殊的结构着色，还可使特殊结构染成与菌体不同的颜色，有利于观察。在细菌检查工作中，除异染颗粒染色法较常应用外，其他持殊结构染色法操作费时，且可用其他简易方法代替，故在日常检验工作中较少使用。3.1.4荧光染色法荧光染料，如金胶等也可对细菌进行染色。此类染料溶于水中，在紫外线照射下能激发出荧光，分为酸性染料及碱性染料两种。细菌用荧光染料染色后在荧光显微镜下检查，可在黑的背景中观察到细菌发出明亮的荧光。用荧光染色法检查细菌可加快检查速度和提高阳性率。用荧光光源和普通光学显微镜配合起来，即可代替荧光显微镜进行荧光染色法检查。3.2细菌染色的基本步骤涂片－干燥一固定一染色－媒染一脱色－复染－镜检单染法不需要媒染一脱色－复染步骤。染色过的细菌涂片标本在镜检时一般使用油浸镜。如果需保存标本，可在镜检后，用拭镜纸沾二甲苯擦掉镜油。长期保存在标本中央滴加一滴加拿大树胶，盖上一洁净的盖玻片，待其自然干燥后，保存于玻片标本盒中。4、常用染色方法及染色液4.1美蓝染色法4.1.1吕氏碱性美蓝染色液美蓝0.3g95％乙醇30mL0.01％氢氧化钾溶液100mL将美蓝溶解于乙醇中，然后于氢氧化钾溶液混合。4.1.2染色法将涂片在火焰上固定，待冷却后滴加染液，染1min～3min，水洗，待干，镜检。4.1.3结果菌体呈蓝色。4.2革兰氏染色法4.2.1染色液(1)结晶紫染色液结晶紫1g95％乙醇20mL1％草酸铵水溶液80mL将结晶紫溶解于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。(2)革兰氏碘液碘1g碘化钾2g蒸馏水300mL将碘与碘化钾先进行混合，加入蒸馏水少许，充分振摇，待完全溶解后，在加蒸馏水至300mL。(3)沙黄复染法沙黄0.25g95％乙醇10mL蒸馏水90mL将沙黄溶解于乙醇中，然后用蒸馏水稀释。4.2.2染色法(1)将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染色液，染1min，水洗。(2)滴加革兰氏碘液，作用1min，水洗。(3)滴加95％乙醇脱色，约30s；或将乙醇滴满整个涂片，立即倾去，再用乙醇滴满整个涂片，脱色10s。(4)水洗，滴加复染液，复染1min，水洗，待干，镜检。4.2.3结果革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色。注：亦可用1：10稀释石炭酸复红染色液作复染液，复染时间仅需10s。4.3耐酸性染色法（萎—倪二氏法）4.3.1染色液(1)石炭酸品红染色液碱性品红0.3g95％乙醇10mL5％苯酚水溶液90mL将品红溶解于乙醇中，然后与苯酚溶液混合。(2)3％盐酸-乙醇浓烟酸3mL95％乙醇97mL(3)复染液吕氏碱性美蓝染色液4.3.2染色法(1)将涂片在火焰上固定，滴加石炭酸品红染色液，徐徐加热至有蒸汽出现，但切不可使沸腾。染液因蒸发减少时，应随时添加。染5min，倾去染液，水洗。(2)滴加盐酸-乙醇脱色，直至无红色脱落为止，（所需时间视涂片厚薄而定，一般为1min～3min），水洗。(3)加吕氏碱性美蓝染色液，复染30min，水洗，待干，镜检。4.3.3结果耐酸性细菌呈红色，其他细菌、细胞等物质呈蓝色。4.4柯氏染色法4.4.1染色液0.5％沙黄液0.5％孔雀绿液4.4.2染色法(1)将涂片在火焰上固定，滴加0.5％沙黄液，并加热至出现气泡，约2min～3min，水洗。(2)滴加0.5％孔雀绿液，复染40s～50s，水洗，待干，镜检4.4.3结果布氏杆菌呈红色，其他细菌及细胞呈绿色4.5奥尔特氏荚膜染色法4.5.1染色液沙黄3g蒸馏水100mL用乳钵研磨溶解4.5.2染色法将涂片在火焰上固定，滴加染色液，并加热至产生蒸汽后，继续染3min，水洗，待干，镜检。4.5.3结果炭疽芽孢杆菌菌体呈赤褐色，荚膜呈黄色。4.6瑞氏染色法4.6.1染色液瑞氏色素0.1g甲醇60mL用乳钵研磨溶解4.6.2染色法(1)待涂片自然干燥后，滴加染色液，固定1min。(2)加入等量蒸馏水（pH6.5），染色3min～5min。(3)用蒸馏水冲洗，待干，镜检。4.7鞭毛染色法4.7.1染色液的配制(1)甲液称丹宁酸5g、氯化高铁（FeCl3）1.5g，溶于100mL蒸馏水中，待溶解后加入1％的氢氧化纳溶液1mL和15％的甲醛溶液2mL。(2)乙液称2g硝酸银溶于100mL蒸馏水中。在90mL乙液中滴加浓氢氧化铵溶液，到出现沉淀后，继续滴加使其变为澄清，然后用其余10mL乙液小心滴加至澄清液中，至出现轻微雾状为止（此为关键性操作，应特别小心）。滴加氢氧化铵和用剩余乙液回滴时，要边滴边充分摇荡，染液当天配，当天使用，2d～3d后基本无效。4.7.2染色法在风干的载玻片上滴加甲液，4min～6min后，用蒸馏水轻轻冲净，再加乙液，缓缓加热至冒汽，维持约半分钟（加热时注意勿出现干燥面），在菌体多的部位可呈深褐色到黑色，停止加热，用水冲净，干后镜检。菌体及鞭毛为深褐色到黑色。五、食品微生物学一般检验技术1、各类食品微生物检样样品的采集与制备实例1.1肉与肉制品样品的采集与制备1.1.1样品的采取(1)生肉及脏器检样如是屠宰场后的畜肉，可于开腔后，用无菌刀采取两腿内侧肌肉各50g（或劈半后采取两侧背最长肌肉各50g）；如是冷藏或销售的生肉，可用无菌刀取腿肉或其他部位的肌肉100g。检样采取后放入无菌容器内，立即送检；如条件不许可时，最好不超过3h。送检时应注意冷藏，不得加入任何防腐剂。检样送往化验室应立即检验或放置冰箱暂存。(2)禽类（包括家禽和野禽）鲜、冻家禽采取整只，放无菌容器内；带毛野禽可放清洁容器内，立即送检，以下处理要求同上述生肉。(3)各类熟肉制品包括酱卤肉、肴肉、方圆腿、熟灌肠、熏烤肉、肉松、肉脯、肉干等，一般采取200g，熟禽采取整只，均放无菌容器内，立即送检，以下处理要求同上述生肉。(4)腊肠、香肚等生灌肠采取整根、整只，小型的可采数根、数只，其总量不少于250g。1.1.2检样的处理(1)生肉及脏器检样的处理先将检样进行表面消毒（在沸水内烫3s～5s，或灼烧消毒），再用无菌剪子剪取检样深层肌肉25g，放入无菌乳钵内用灭菌剪子剪碎后，加灭菌海砂或玻璃砂或玻璃砂研磨，磨碎后加入灭菌水225mL，混匀后即为1：10稀释液。(2)鲜、冻家禽检样的处理先将检样进行表面消毒，用灭菌剪子或刀去皮后，剪取肌肉25g（一般可从胸部或腿部剪取），以下处理同生肉。带毛野禽去毛后，同家禽检样处理。(3)各类熟肉制品检样的处理直接切取或称取25g，以下处理同生肉。(4)腊肠、香肠等生灌肠检样处理先对生灌肠表面进行消毒，用灭菌剪子取内容物25g，以下处理同生肉。注：以上样品的采集和送检及检样的处理均以检验肉禽及其制品内的细菌含量从而判断其质量鲜度为目的。如须检验肉禽及其制品受外界环境污染的程度或检索其是否带有某种致病菌，应用棉拭采样法。1.1.3棉拭采样法和检样处理检验肉禽及其制品受污染的程度，一般可用板孔5cm2的金属制规板，压在受检物上，将无菌棉拭稍沾湿，在板孔5cm2的范围内揩抹多次，然后将板孔规板移压另一点，用另一棉拭揩抹，如此共移压揩抹10次，总面积50cm2，共用10只棉拭。每支棉拭在揩抹去完毕后应立即剪断或烧断后投入盛有50mL灭菌水的三角烧瓶或大试管中，立即送检。检验时先充分振摇吸取瓶、管中的液体，作为原液，再按要求作10倍递增稀释。检验