食品生物技术复习资料

第一章绪论•生物技术—定义为“红色生物技术”、“绿色生物技术”和“灰色生物技术”三类。“红色生物技术”是指生物制药技术,“绿色生物技术”是指农业和食品生物技术,而“灰色生物技术”是指工业、环保生物技术。•食品生物技术---现代食品生物技术的作用•一食品原料和食品微生物的改良，提高食品的营养价值及加工性能；•二生产各种功能食品有效成份、新型食品添加剂；•三可直接应用于食品生产过程的物质转化；•四工业化生产预定食品或食品功能成分。第二章基因工程4个问题：1.什么是基因工程——基因工程的概念在体外通过人工剪、接，将不同来源的DNA分子组成一个杂合DNA分子(DNA分子重组体)，然后导入宿主细胞去复制扩增或表达。因为通过人工设计,得到一定的设计方案，故称为基因工程.由于整个操作在分子水平上进行，所以也称分子克隆。基因工程的基本特点是，分子水平操作，细胞水平表达。2.为什么能进行基因工程——基因工程的原理和技术（涵盖3大理论和3大技术准备）四．基因工程3大理论，3大技术准备：（一）理论上的3大发现：1.20世纪40年代，Avery发现了生物遗传物质的化学本质是DNA。超越时代的科学成就往往不易被人们接受，Avery当时并未赢得阵阵掌声，他的论文事隔10年以后才公开发表。2.20世纪50年代，Watson-crick提出了DNA结构的双螺旋结构模型，搞清楚了生物遗传物质的分子机制。3.20世纪60年代，确定了遗传信息的传递方式：DNA→RNA→Pr,破译了全部遗传密码，43。1．“基因剪刀”－限制性内切酶的发明2．载体(“交通工具车子”)－将质粒作为基因工程载体使用3．逆转录酶3.怎样进行基因工程——3大步骤（DNA体外重组，重组DNA如何进行扩增和表达，基因工程后处理）4.基因工程的应用和前景（一）基因（gene）基因------从化学上来说，指的是一段DNA或RNA顺序，该顺序可以产生或影响某种表型（genotype，phenotype）；从遗传学上来说，基因代表一个遗传单位，一个功能单位，一个突变单位。（二）基因工程（geneticengineering）基因工程--------在体外通过人工剪、接，将不同来源的DNA分子组成一个杂合DNA分子(DNA分子重组体)，然后导入宿主细胞去复制扩增或表达。因为通过人工设计,得到一定的设计方案，故称为基因工程。由于整个操作在分子水平上进行，所以也称分子克隆。基因工程的基本特点是，分子水平操作，细胞水平表达。在这个过程中：1.“基因剪刀”剪取DNA的酶就像一把“基因剪刀”2.“缝纫针”连接不同来源DNA分子的酶就像一根“缝纫针”，使二者连在一起3.“交通工具”使用载体好比一辆车子4.“乘客”有用基因（二）技术上的3大发明：1．“基因剪刀”－限制性内切酶的发明（1）20世纪40－60年代，科学家们就为基因工程设计了美好的蓝图，但是面对庞大的dsDNA（104，2.2*1011公里）束手无策，无从下手把它切成单个基因片断。（2）当时的酶学知识已有相当的发展，但是没有一个已发现的酶能完成这样的使命。（3）1970年，Smith和Wilcox在流感嗜血杆菌（Haemophilusinffuenzae）分离纯化了HindⅡ，取得了突破，打破了基因工程的禁锢，迎来了改造生物的春天，为基因工程奠定了最为重要的技术基础。2．载体(“交通工具车子”)－基因工程技术诞生的第二个技术准备（1）有了切割与缝合（ligase）基因DNA的工具，还得有一个车子-----将重组DNA送到宿主细胞中去。（2）1946年起，Lederberg就研究细菌性因子（F因子）.50-60年代相继发现了R因子（抗药因子），CoE(大肠杆菌因子)等质粒。（3）然而，直到1973年Cohen才能将质粒作为基因工程载体使用（至今一直是基因工程最重要最广泛使用的载体）。这是基因工程的第二个技术准备。3．逆转录酶－1970年Baltimove和Temin等同时各自发现了逆转录酶，打破了遗传学（生物学）中心法则，使真核基因的制备成为可能。（为什么）(1)真核基因组庞大而复杂，不易制得基因图谱。HGP2005年完成，2.8万个基因，1－3kb/基因，104，2.2*1011公里。（2）即使有了基因图谱，因为真核基因有内含子，不能在原核表达系统剪接出mRNA，没有成熟的mRNA就不能得到相应得产物。（3）经过逆转录mRNA→cDNA(complementoryDNA)文库要比基因组文库小得多，所以筛选阳性克隆就方便得多。有了这些理论核技术的武装，基因工程的临盆降生指日可待，Berg和Cohen两位科学的“助产士”，把基因工程接到了人间。第二节基因工程的酶学基础常用的工具酶（toolenzymes）有：1.限制性核酸内切酶（resrictionenzymes,restrictionendonadease)----定义，分类，命名1.定义一类专门切割DNA的酶，它们能特异结合一段被称为限制酶识别顺序的特殊DNA序列。并切割dsDNA。2.分类限制酶都是从原核生物中发现的（400多种E/350M）。所有的限制酶可分成3类。（1）Ⅰ、Ⅲ型，兼具限制与修饰活性，它们识别与切割顺序不在一个地方，不产生特异性的DNA片段，与基因工程意义不大（有说Ⅲ型识别核苷酸切割的位点一致，但罕见）。（2）Ⅱ型基因工程说到的限制酶是Ⅱ型酶，具有此类酶的微生物限制－修饰系统分别由限制酶核甲基化酶来完成。Ⅱ型酶分子量小，仅需Mg2＋作为催化反应的辅因子，识别与切割位点相同，产生特异的DNA片段。3.命名（1973年Smith原则、Ⅱ型酶）根据分离此酶微生物的学名，一般取3个字母。第一个字母大写该微生物属名前的第一个字母第二、三个字母小写该微生物种名前的2个字母第四个字母大写有变种或品系的第一个字母罗马字母Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ从一种微生物中发现了几种限制酶，按发现顺序排列2.DNA连接酶（DNAligase,ligase)—功能、影响连接酶作用的因素、连接方法（一）功能：催化有互补顺序的两个dsDNA分子的粘性末端或平头末端3′－OH、5′－P连接作用。只能连接缺口（nick），不能连接裂口（gap）。而且被连接的DNA链必须是双螺旋DNA分子的一部分。（二）来源－噬菌体T4感染E.coli分离的一种单链多肽酶、MW.68KD。（三）催化反应：（1）需要ATP、Mg2+作辅助因子；（2）对粘性末端催化活性大于平头末端（酶量1：100）•体外连接的几种方式：1.用ＤＮＡ连接酶连接具有互补粘性末端的DNA片断2.用Ｔ４ＤＮＡ连接酶将平末端的DNA片断连接；3.用末端脱氧核苷酸转移酶给具平末端的DNA片断加上poly(A)-poly(T)尾巴之后，再用ＤＮＡ连接酶连接。4.先在DNA片断末端加上化学合成的衔接物或接头，形成粘性末端后，再用ＤＮＡ连接酶连接影响连接酶作用的因素1.反应温度：连接缺口的温度：37度连接粘性末端的最佳温度：4～15度2.Ｔ４ＤＮＡ连接酶的用量：平末端DNA分子的连接反应中，最适1～2个单位。粘性末端DNA片断之间的连接，酶浓度0.1个单位ATP的用量10μmol-1mmol/L之间3.提高外源片断与载体的浓度的比值（10～20倍）粘性末端DAN片断的连接由于具粘性末端的载体易发生自连。对载体的5’末端进行处理，用细菌的或小牛肠的碱性磷酸酶移去磷酸基团，使载体不能自连。而外源片断的5’-P能与载体的3’-OH进行共价键的连接。这样形成的杂种分子中，每一个连接位点中载体DNA只有一条链与外源片断相连，失去5’-P的链不能进行连接，形成3’-OH和5’-OH的缺口。平末端DNA片断的连接1）.T4DNA连接酶2）.用末端核苷酸转移酶给平末端加上同聚物尾巴之后，再用DNA连接酶连接。衔接物连接法平末端的另一种处理方式是利用衔接物（linker）进行处理，人工加上粘性末端。衔接物是一种人工合成的小分子DNA，约10~20个核苷酸，其结构特征是含有多种限制性核酸内切酶的酶切位点的回文结构。将衔接物分子与平末端DNA分子连接，再用限制性核酸内切酶酶切，便可产生粘性末端。这种方法的优点是克隆位点具有限制酶的酶切位点。DNA接头（adapter）连接法：它是一类人工合成的一头具有某种限制酶粘性末端另一头为平末端的特殊的双链寡核苷酸短片断。粘性末端容易通过碱基配对形成如同衔接物一样的二聚体分子。对DNA接头分子末端，进行必要的修饰。移走粘性末端5’-P，暴露出5’-OH，不能产生稳定的二聚体分子。3.DNA聚合酶(DNApolymerase,DNApol)–定义把脱氧核糖核苷酸连续的加到双链DNA分子引物链的3’-OH末端，催化核苷酸的聚合作用，而不发生从引物模板上解离的情况。7.碱性磷酸酶(BAP或CIP)---该酶用于脱去DNA（RNA）5’末端的磷酸根，使5’-P成为5’-OH，该过程称核酸分子的脱磷酸作用。当需要5’端同位素标记或为了避免DNA片段自身连接（或环化）时可进行脱磷酸反应。以1.和2.最为常用，最为重要。工具酶现已商品化。第第三三节节载载体体载体的概念：1.要把一个有用的基因（目的基因——研究或应用基因）通过基因工程手段送到生物细胞（受体细胞），需要运载工具（交通工具）携带外源基因进入受体细胞，这种运载工具就叫做载体（vector）。2.凡来源于质粒或噬菌体的DNA分子，可以插入或克隆DNA片段统称为vector。3.基因工程所用的vector实际上是DNA分子，是用来携带目的基因片段进入受体细胞的DNA基因工程载体的3个特点（一）能独立自主的复制载体DNA分子中有一段不影响它们扩增的非必需区域，如MCS，插在其中的外源DNA片段，能被动的跟着载体一起复制/扩增，就像载体的正常成分一样。（二）能便利的加以检测如载体的药物抗性基因，多是抗生素抗性基因，将受体细胞放在含有该抗生素培养板上培养生长时，只有携带这些抗性基因的载体分子的受体细胞才能存活。（三）都能容易进入宿主细胞中去，也易从宿主细胞中分离纯化出来。噬菌体载体λ-噬菌体结构特点：1、野生型为48.5kb，两端带有12碱基的单链粘性末端，进入大肠杆菌后环化，既可溶菌又可溶原生长。2、基因组分为三个区域：左侧区包括使噬菌体成熟的全部基因；中间区不是病毒生活必需的，外源DNA片段往往插入此区；右侧区包括所有的主要调控成分。3、λ-噬菌体基因组中只有60%是溶菌生长必需的，作为克隆载体时，可插入9~23kb的外源DNA片段质粒载体(1)染色体外的双链环状DNA分子(2)大小为1～200kb；(３)能独立于染色体外进行自我复制，每个细胞中可含10～200个拷贝。(4)分高拷贝数和低拷贝数质粒或窄宿主范围和广宿主范围(5)质粒包含：复制起始区、选择标记基因和限制性核酸内切酶的酶切位点常用质粒有：pBR322、pUC19质粒的不相容性：同种的或亲缘关系相近的两种质粒不能同时稳定地保持在一个细胞内的现象3.柯氏质粒／粘尾质粒(cosmid)柯氏质粒定义:含有入噬菌体粘性末端的复合质粒。由入-DNAcos区与质粒重组建造而成.在宿主细胞中可以作为正常噬菌体进行复制，但不表达噬菌体的任何功能。含有质粒的抗药性标记如Ampr基因或Tetr基因及自主复制成分，所以这种粘性质粒可以在细菌中大量复制扩增。当体外重组的粘性质粒分子包装成噬菌体颗粒并感染大肠杆菌后，可按质粒的方式进行复制。②带有噬菌体的粘性末端(cos区)。这一粘性末端是体外包装系统必不可少的成分，所以它可以像噬菌体一样进行体外包装。③具有一个或多个限制酶的酶切位点。④其本身分子量小，如pHC79仅6.5kb，可容纳40kb左右的DNA片段。⑤由于非重组体粘性质粒很小，不能在体外包装，因而体外包装的主要是重组体，有利于以后的筛选。第四节基因工程技术与方法基因工程包括3个步骤：1．DNA重组DNA分子内或分子间发生的遗传信息的重新共价组合过程。包括同源重组、特异位点重组和转座重组等类型，广泛存在于各类生物。体外通过人工DNA重组可获得重组体DNA，是基因工程中的关键步骤2